產品編號 LIBTM-RO
選擇適當的 Liberase 研究級混合酵素
您目前的組織解離方案，以及您使用傳統 膠原蛋白酶是選擇合適的 Liberase 混合酶的良好指南。請選擇與您的組織解離應用最相似的 Liberase 混合酶，或根據特定製造商和膠原蛋白酶類型來選擇。請參考 "Liberase Research Grade Enzyme Blends Technical Tip - April 2010"，或前往 Roche Special Interest Site Tissue Dissociation。持續更新的表格包含各種組織解離應用、推薦的 Liberase 混合酶及其起始濃度。該表格也提供每個應用的全文規程或引文連結：
有關使用Liberase研究級混合酶的方案，請瀏覽羅氏興趣網站組織解離。以下工作程序已在羅氏R&D部門例行並成功用於以下細胞的分離：
- 來自大鼠肝臟的肝細胞
- 來自大鼠和小鼠胰腺的胰島細胞
- 來自大鼠附睾脂肪墊的脂肪細胞
- 來自人類臍靜脈的內皮細胞
請注意，以下上述程序中給出的特定酵素的工作濃度是一般指南，應根據個人需求進行調整。
大鼠肝細胞的分離
建議使用膠原蛋白酶 H 分離大鼠肝細胞。為了獲得高產量的完整細胞（高達 95%），使用膠原蛋白酶灌注肝臟是首選的方法1-3。灌注經由肝門靜脈分兩步進行，首先（第一步）使用去鈣溶液（不含 Ca2+ 和/或含 EGTA），接著使用含膠原蛋白酶的培養基（第二步）。由於膠原蛋白酶需要 Ca2+，因此在第二步中應該有 Ca2+。
設備和灌注儀器
有關設備和灌注儀器的詳細資訊請參閱參考資料 2.
溶液
灌注培養基（20 x；儲備溶液）：NaCI, 138.0 g/l; KCI, 8.9 g/l; Na2HP04, 11.4 g/l; NaH2P04, 5.4 g/l；葡萄糖，180.0 g/l；MgS04 x 7 H20，6.0 g/l；無菌。灌注培養基（1 x 工作溶液；每個肝臟 1 I）：50 ml 灌注培養基 (20 x)；22.5 ml 無菌 NaHCO3，7.5%；2 ml 無菌酚紅色，0.5%；用無菌再蒸餾水注滿 1000 ml；調整 pH 至 7.4（用 1 N HCI 或 1 N NaOH）。建議用此培養基灌注肝臟和洗滌細胞。在第一個灌注步驟中，可將 0.08 g/l（0.2 mmol/l，無菌）的 EGTA 加入灌注培養基（1 x）中（見參考資料 2，4）。在第二個灌注步驟中，準備膠原蛋白酶 H 溶液加入灌注培養基（1 x）中。為此，將 100 mg 的膠原蛋白酶 H 溶於 4 ml 灌注培養基 (1 x) 中（最終濃度 25 mg/mL）並過濾（0.2 μm 過濾器）。為了活化膠原蛋白酶，應將 2.5 ml 無菌 CaCI2 solution, 200 mmol/l，加入 100 ml 膠原蛋白酶灌注培養基。
培養基
DMEM（1.1 g/l glucose），含 MEM 維生素 1 x；MEM 氨基酸 1 x；非必需氨基酸 1 x；谷氨酰胺，2 mmol/l；乳酸（pH 7.4），1 %；青霉素/鏈黴素，1 %。在培養細胞前立即加入 5% 的胎兒小牛血清 (FCS)。亞培養時，在培養液中加入地塞米松（10-4 mmol/l）和胰島素（2 x 10-5 mmol/l）。對於無血清子培養，應以 1 mg/mL 的 BSA 取代 FCS。這些培養基配方可在第一次交換培養基後（電鍍後 90 分鐘）使用。
膠原包衣溶液
將 20 毫克膠原，例如膠原（I 型）或膠原（大鼠尾部）溶於 10 毫升無菌醋酸，0.1 N（最終濃度 2 毫克/毫升），或使用無菌膠原溶液，例如膠原 S、戊巴比妥钠，例如 Nembutal®、肝素钠， e.g.、Liquemin® 25000®
程序
用 50 μg 麻醉雄性 Spraque-Dawley 大鼠（體重約 200 g）。200 g）用 50 μg Nembutal® /g（活體重量）（i.p.）麻醉，並打開腹部。用約 0.5 ml liquemin 噴灑肝臟和腸道以避免凝固。揭開肝臟，將插管注入門靜脈。以灌注介質 Ca2+-free 開始灌注（第一步），H2O 壓力為 50 毫升。丟棄前 50 毫升以去除紅血球和血漿蛋白。移除肝臟並移至灌注設備中，該設備可將灌注液溫度保持在 +37 °C，同時持續為其充氧。以 40 ml/min 的流速，使用 100 ml 的灌注介質 (1x) 與碳精 (95% O2，5% CO2)充氧，灌注肝臟 (經由腔靜脈回流再循環) 5 分鐘。在灌注介質中加入無菌膠原蛋白酶溶液（4 ml 25 mg/mL 溶液）（最終濃度約 1 mg/mL），繼續灌注 10 至 30 分鐘（第二步驟）。
灌注後，將肝臟放入含有約 20 ml 灌注液 (1 x) 的無菌 50 mm 培養皿中，用兩把無菌鉗弄破肝蓋，輕輕搖動器官使肝細胞離解。移除未解离的组织碎片，分别用 74 μm 过滤器或 4 片无菌纱布过滤细胞悬液。將濾液收集於無菌燒杯中，並注入 200 ml 灌流培養基（1 x；使用碳源充氧）。將細胞懸浮液以 50 ml 的份量旋轉 60 秒（50 x g，室溫），並將細胞重懸於灌注培養基（1 x；使用碳源充氧）中，減少 50%的容量。重複此清洗程序兩次，每次減少 50%。將細胞重懸於含 FCS 的培養液中，並將 3 x 105 cells/ml 種植於膠原包被（2.5 μL/cm2 of a 2 mg/mL collagen-coating solution）的培養器皿中。在 +37 °C 與 5% CO2 下培養。培養 90 分鐘後移除培養液和未附著的細胞。對於進一步的細胞培養（subculture），可使用不含血清的培養液。
Liberease研究級：皮膚組織
來自德國斯圖加特Fraunhofer研究所的羅氏外部合作夥伴已系統地檢驗了Liberease研究級混合酶，用於從人類包皮組織表皮中分離角化細胞和成纖維細胞。請瀏覽 Roche Special Interest Site Tissue Dissociation 以獲得更多資訊。
建議用於大鼠心肌細胞的 Liberase Research Grade
建議使用約 200 μg/ml 的 Liberase DH Research Grade。請在我們的特別興趣網站 Tissue Dissociation 上尋找協議。此外，Liberase 資料庫還提供了許多其他方案。
Liberase Research Grade：脂肪組織的解離
使用第二代 Liberase 研究級產品從脂肪組織中分離細胞的應用資料尚未提供。但在羅氏專題網站組織解離中，有使用第一代產品Liberase Blendzyme 3分離脂肪細胞的方案。
從以前的Liberase Enzyme Blends"過渡"部分可能有助於選擇相應的新產品，容易轉換濃度：Paraffin Embedded Tissue
使用Liberase酵素從石蠟包埋組織中分離細胞的效果尚未進行評估。
細胞外抗原的檢測
從脾臟中提取樹突狀細胞的方案可在Roche Special Interest Site Tissue Dissociation上獲得。為了制定此方案，我們測試了所有五種新的 Liberase 研究級混合酶。使用 Liberase TL 和 DL 研究級混合酵素獲得最佳結果。
注意： 以上所有方案均由客戶開發，未經羅氏驗證。羅氏對協議的內容和成功執行不承擔任何責任。
FACS分選前嚙齒動物新生兒腦組織的細胞解離
羅氏不提供使用Liberase研究級混合酶分離嚙齒動物新生兒腦組織的方案。作為此應用的起點，Liberase DH 和 DL 研究級是最溫和的產品，因為這些 Liberase 複合酶中提供的中性蛋白酶是 Dispase®。
使用 Liberase TM 研究級
從肺部腫瘤組織分離細胞從肺部腫瘤組織分離細胞的實驗細節，請參閱 Roche Applied Science Special Interest Site 上的出版物。作為起點，每克肺組織使用含 0.25 W¼nsch Units/ml Liberase TM Research Grade 的 10 ml 工作溶液。
疑難排解
酵素成份
所有的 Liberase 研究級酵素混合物都是由膠原蛋白酶 I、II 和中性蛋白酶混合而成。Liberase TL、TM 和 TH 研究級含有膠原蛋白酶 I、II 和中性蛋白酶熱溶解酶。
請參閱 Roche Special Interest Site Tissue Dissociation，瞭解這些混合酵素的侵蝕性有何不同，並找出適合您應用的 Liberase Research Grade。如果您的應用沒有包含在我們目前的資料庫中，請到下一節，"Liberase TM Research Grade."您也可以根據您使用第一st 代 Liberase Blendzymes 和使用傳統膠原蛋白酶的經驗，使用 Liberase 酵素選擇指南來選擇 Liberase Research Grade Enzyme Blend.
膠原蛋白酶和 Liberase Blendzymes：
傳統膠原蛋白酶製劑是從細菌（組織溶解梭菌）培養上清液中分離出來的。這些製劑是異質的，含有多達 30 種不同的酵素、細胞碎屑、色素和內毒素。內毒素含量和變異性是傳統膠原蛋白酶的最大缺陷。Liberase 酵素具有許多優點，與傳統的膠原蛋白酶有顯著的區別。由於每一種 Liberase 純化混合酵素都是使用反應面模型針對不同的應用而特別調配，因此可以預期在以下方面獲得最佳的結果：
- 增加細胞產量
- 增進細胞活力
- 增強細胞功能
每批 Liberase 都具有相同的酵素活性規格。每個批次都經過內毒素測試，以確保其含量持續維持在低水平。不再需要進行批次選擇或整批預留。
更詳細的資訊，請參考組織解離專題網站。
RNAse污染
不含RNAase不是Liberase生產程序的品質控制標準。在組織解離過程中，細胞被破壞，RNase 被釋放。因此，不含 RNase 的品質不會帶來額外的好處。
利巴酶的研究級成分是高度純化的制劑。HPLC 色譜圖顯示，除了膠原蛋白酶 I 和 II 以及中性蛋白酶之外，沒有其他蛋白質。
利巴酶研發級分析證書
第二代利巴酶研發級產品的分析證書（CoAs）顯示Col Ia、Col I和Col II的含量、內毒素含量和凍乾外觀。活性值在 CoA 中提供。
第二代 Liberase 產品中，中性蛋白酶的活性測試也有所改變。不再測量 FITC 酪蛋白單位。FITC 測試已被非螢光活性測試所取代。中性蛋白酶的數量沒有改變。使用新測試確定的中性蛋白酶活性，與之前確定的 FITC 單位相符。
膠原蛋白酶/纖維酶研究級混合酶：不同類型的分類
細菌膠原蛋白酶，或更準確地說是梭狀肽酶 A，是一種對 Pro-X-Gly-Pro 序列中的 X-Gly 鍵具有特異性的蛋白酶，其中 X 通常是中性氨基酸。這種序列在膠原蛋白中出現的頻率很高，在其他蛋白質中則很少見。純化的梭狀芽孢桿菌肽酶 A 在解離組織方面效果不佳，這是因為膠原蛋白多肽的水解不完全，而且對細胞外基質中高濃度的非膠原蛋白和其他大分子的活性有限。最常用於組織解離的膠原蛋白酶是來自細菌 組織溶解梭狀芽孢桿菌 的粗制劑，包含梭狀芽孢桿菌肽酶 A，以及一些其他蛋白酶和脂肪酶。
粗制膠原蛋白酶是不同酶活性的混合物，使它們成為幾種市售膠原蛋白酶的基礎。這些膠原蛋白酶類型在膠原蛋白酶和其他蛋白酶的相對含量上各不相同，包括clostripain、一種具有類似胰蛋白酶活性的蛋白酶和一種中性蛋白酶。例如，Roche 的膠原蛋白酶 A、B 和 D 含有不同比例的各種蛋白水解活性，而膠原蛋白酶 H 和 P 則經過功能測試，可分離出大鼠的肝細胞 (H) 和胰島 (P)。
羅氏膠原蛋白酶以 W¼nsch 單位進行分析（W¼nsch 底物在 +25 °C 下每分鐘形成 1 pmol 的產物）。膠原蛋白酶活性通常以 Mandl 單位來表示（在 +37 °C 下 5 小時內從膠原蛋白中釋放出 1 μmol 亮氨酸）。到目前為止，這兩種活性單位還沒有公認的換算因子，因為單位部分取決於膠原蛋白酶製劑中污染蛋白酶的濃度，這是一個無法確定的變數。
重組：
- 將重組緩衝液的容量增加2倍。
- 快速旋轉。
優化您的組織解離程序：
優化的重點：
- 利巴酶研究級純化酶混合物只包含膠原蛋白酶和中性蛋白酶。
- 膠原蛋白酶消化細胞間基質。
- 中性蛋白酶與膠原蛋白酶發揮協同作用。
- 在足夠的時間和濃度下，中性蛋白酶會破壞細胞表面蛋白。
- 解離時間、酶比例和酶濃度都會影響組織解離結果。
- 使用 Liberase 研究級純化混合酵素時，請勿使用血清、BSA 或蛋白酶抑制劑等改良因子。
請注意使用 Liberase 酵素所分離出的細胞，其產量、存活率或功能是否不如理想。找出可能的原因，然後按建議行事。請參考 「生物活性 」中描述的酵素混合物的激勵性，以獲得關於在 Liberase 研究級面板中增加中性蛋白酶特定活性的資訊。
參考資料
LIBERASE 是 Roche 的商標
所有其他產品名稱和商標屬於其各自所有者的財產。
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