使用包裝混合質粒製備慢病毒轉導粒子

 

簡介

MISSION^® Lentiviral Packaging Mix（產品編號 SHP001）是由兩個表達關鍵 HIV 包裝基因和一個異源病毒包膜基因的質粒組成的優化配方。MISSION^® 慢病毒粒子由三種主要成分產生：

1. 包裝載體，包含產生病毒體結構蛋白和包裝功能所需的最小慢病毒基因集。
2. 水泡性口炎病毒 G 蛋白（pCMV-VSVG）包膜載體，它為偽型化提供異源包膜。
3. shRNA轉移載體（pLK0.1），它包含感興趣的序列以及 RNA 生產和包裝所需的順式作用序列。

材料

• 293T細胞（轉染當天處於對數生長且70%融合度）
• 培養基 - DME培養基（產品編號. D6429），輔以10%胎牛血清（Product No. F2442）和 4 mM L-谷氨酰胺（Product No.G6392）
• 轉染試劑
• 96孔組織培養板
• 組織培養箱：37 °C，5% CO₂，100% 相對濕度
• 組織培養罩中的組織培養層流罩僅開放優化板
• 慢病毒包裝混合液（Product No. SHP001)

。

Protocol for Lentiviral Transduction

Day 0

0.1 Seed HEK293T cells (20,000 cells/well of 96-well plate) in complete DME media.

第 1 天

1.1 在室溫下解凍小瓶慢病毒包裝混合液並放置在冰上。

1.2 把三支空的聚丙烯管放在冰上。

1.3 在第一支管中每孔加入 1 µL 的慢病毒包裝混合物。

1.4 在第二支管中加入每孔 15 µL 的無血清 DME 和 0.6 µL 的轉染試劑 Fugene 6。

1.5 在第三支管中加入每孔 0.1 µg 的 shRNA 轉移載體。

1.6 将所有转染鸡尾酒成分混合在一个聚丙烯小瓶中。

1.7 用移液管上下轻轻混合。

1.9 將混合液平均分配到要轉染的孔中。

1.10 在組織培養箱中 37 ℃ 培養細胞過夜。

Day 2

2.1 轉染後 16 小時，從轉染細胞中輕輕移除培養基（避免擾亂細胞），並在 96 孔板的每孔中換上 100 µL 的預溫完全培養基。

2.2 將細胞在培養箱（37 °C，5% CO₂）中再培養 24 小時。

Day 3

3.1 在進行 3.A、3.B、3.C、3.D 前，雙手套。

3.2 輕輕移除現在含有病毒的上清液，並將其放入收集板中。

3.3 在孔中加入新鮮的完全 DME，並在 37 °C 下培養細胞過夜。

3.4 蓋上蓋子，將收集板置於 4 °C。

第 4 天

4.1 在進行 4.2 之前戴上雙重手套。

4.2 從孔中取出第二次病毒上清，加入前一天的收集板中。

4.3 用 p24 ELISA 測定滴度。4 將病毒密封保存於 -80 °C。

註釋：

• 經實驗判定，第一次採集的滴度略高於第二次，但將兩者匯集不會顯著降低樣本的總滴度。
  

第 0 天

• HEK293T細胞應保持有限的傳代次數。
• 在轉染前，將細胞種植過夜（不超過 24 小時）。

第 1 天

• 檢查產品的體積和外觀。僅使用無菌聚丙烯試管以防止污染。
• 強烈混合可能破壞轉染複合物的形成。
• 在孵育過程中不要打擾試管，因為轉染複合物是在孵育過程中形成的。
• 輕輕地向細胞中加入轉染雞尾酒，以順時針方向從孔中心向兩側均勻地滴加。

第 2 天

• 第一次收集的病毒可在 2-8 °C 下保存 24-48 小時。

第 4 天

• 每次凍融週期都可能導致後續滴度降低。建議製備小量的病毒儲備液，並儲存在 -70 °C，直到準備使用為止。