慢病毒的 FACS 滴定協議

確定慢病毒顆粒的功能滴度

FACS 分析 CFU

FACS（螢光活動細胞分類）提供了一種方法，可根據每個細胞的特定光散射和螢光，將混合的細胞群分類為兩組或多組，每次一個細胞。

方案：

注意：以下方案包括使用聚芘來增強轉導。
第1天


在第2天，在六孔板中種孔，以達到 30-50%的融合度。在正常培養條件下孵育細胞過夜。
 
第 2 天

1. 將一小瓶慢病毒粒子在冰上解凍，直到冰晶消失；輕輕拍打小瓶數次，進行混和。
   
2. 準備含有溴化六甲嘧啶（polybrene）的培養基，最終濃度為 8 µg/mL。
   注意：polybrene 可增強大多數類型細胞的轉導。有些細胞對聚苄胺敏感，有些則不會增強轉導。包括 +/- polybrene 的對照，以確定是否應與被轉導的細胞系一起使用。
   
3. 在含聚貝尼的完整培養基（如需要）中，使用下表作為指南，製備 2 mL 慢病毒製備液的十倍序列稀釋液，從 1 x 10^-1 to 1 x 10^-5 in polybrene containing complete media (if needed).在每個步驟中，攪拌均勻以確保每個試管中的混合物均勻，並在稀釋之間更換移液器吸頭。

Tube 編號	稀釋係數	病毒量
1	1x10	22 µL	2178 µL
2	1x10-3	220 µL 试管 #1	1980 µL
2
3	1x10-4	220 µL 试管 #2	1980 µL1980 µL
4	1x10-5	220 µL 试管 #3	220 µL管 #3 的 L	1980 µL
5	1x10-6	220微升的管#4	1980微升

4. 移除所有孔中的培養基。
5. 向複製板的孔中加入 1 mL 慢病毒稀釋液，留下一孔單獨加入培養基，作為陰性、非轉換對照。

第 3 天

1. 從所有孔中移除含有慢病毒粒子的培養基。
   
2. 每孔加入 2 mL 新鮮培養基（不含聚乙烯）。
   
3. 將細胞放回培養箱。

Day 4-6

在顯微鏡下觀察細胞是否表達螢光報告基因。

1. 移除培養基，用 3 mL Dulbecco's PBS 溫和清洗細胞。
   
2. 每孔加入0.5 mL胰蛋白酶/EDTA使細胞脫離，然後在37 °C下孵育1分鐘。
   
3. 將 300 μL 細胞轉移到 5 mL FACS 管中。
   
4. 使用 FACS 分析細胞的 GFP 表達。

分析

計算功能滴度時，選擇1%至20%螢光體陽性（FP-陽性）的群組。FP 陽性率低於 1%，FACS 可能無法可靠地判斷陽性細胞的數量；FP 陽性率高於 20%，每個陽性目標細胞被轉導兩次的機會大幅增加，導致轉導粒子的數量被低估。

TU/mL = (initial cell count * % GFP positive)/dilution
 
現在我們知道慢病毒粒子的功能滴度與 p24 ELISA 滴度的關係，我們可以建立準確的 MOI (Multiplicity of Infection) 並進行轉導。