體外將人類 PBMC 和 CD34+ 衍生的單核細胞分化為成熟的 CD83+/CD14- 樹突狀細胞

樹突狀細胞（Dendritic Cells，DCs）是高度移動的免疫細胞，也是哺乳類動物免疫系統中最強大的抗原呈递細胞（APCs）。¹ DCs作為先天性免疫系統和適應性免疫系統之間的信使，通過內吞作用不斷採樣環境中的抗原。¹ DC負責誘導T細胞依賴性免疫和耐受，在上皮（皮膚和腸道）和其他經常遇到入侵病原體的組織中尤其豐富。² 目前，人類已知有兩種主要的樹突狀細胞類型：1）來自血液中質細胞的淋巴樹突狀細胞；2）來自髓系前體細胞的髓系樹突狀細胞，如外周血單核細胞（PBMCs）或骨髓中的CD34+造血祖細胞。 ¹ DCs透過外源或內源刺激誘導的成熟過程而發育（圖1）。).最近，樹突狀細胞被用於潛在的癌症免疫治療³ 以及自身免疫疾病的治療。⁴ 由於DCs在HIV感染⁵ 和其他幾種病毒的發病機理中也扮演著重要的角色，因此它們具有治療目標的意義。

PromoCell的樹突状細胞生成培養基（C-28050）可以高效可靠地將人類單核細胞（hMo）分化為未成熟和完全成熟的CD83+/CD14-樹突状細胞。該培養基可用於將冷凍保存的純化單核細胞分化為 moDCs。此外，當與 PromoCell Monocyte Attachment Medium (C-28051) 結合時，該培養基也可用於新分離的單核細胞和 MNC。化學定義且不含異種物質的 PromoCell Dendritic Cell Generation Medium DXF (C-28052) 完全由合成、重組或植物來源的材料配製而成，建議用於新分離的單核細胞或單核細胞 (MNC)。

圖 1. 人類 PBMC 和 CD34+ 衍生單核細胞分化為成熟的 CD83+/CD14 樹突狀細胞。

樹突狀細胞分化協議

協議A：使用DC生成培養基DXF從新分離的細胞中生成moDCs

要從新分離的外周血單核細胞或單核細胞中生成moDCs，PromoCell建議使用樹突狀細胞生成培養基DXF (C-28052)。

另外，也可使用樹突狀細胞生成培養基 (C-28050) 與單核細胞附著培養基 (C-28051) 組合。

1. 讓細胞附著（第 0 天）。 將新鮮分離的細胞放入適量的 PromoCell DC Generation Medium DXF (C-28052) w/o cytokines 中。單核細胞密度為 2-3 百萬/cm² 純化單核細胞密度為 0.5 百萬/cm²。在 5%CO₂ 和 37 °C的培養箱中培養 1 小時。
2. 清洗黏附細胞部分（第 0 天）。用力攪拌組織培養容器，鬆開非黏附細胞並吸出它們。用溫的 PromoCell DC Generation Medium DXF (C-28052)（不含細胞因子）洗粘附細胞三次，方法是攪拌容器並吸出上清液。
3. 開始分化為未成熟的 moDC（第 0 天）。 加入適量的 PromoCell DC Generation Medium DXF (C-28052)，輔以 1x Component A of the Cytokine Pack moDC DXF (supplied at 100x) and incubate for 3 days at 37 °C and 5% CO₂。
4. 更換培養基（第 3 天）。 在第 3 天進行培養基更換：吸出細胞中的培養基並收集到離心管中。立即用移液管移取新鮮的 PromoCell DC Generation Medium DXF (C-28052)，補充 1x Component A of the Cytokine Pack moDC DXF 至細胞中。丟棄上清液，小心地將細胞重懸於少量新鮮培養基。
5. 完成 moDC 成熟過程（第 6 天）。 為了完成 moDC 成熟過程，請在第 6 天以 1x 的 Cytokine Pack moDC 成分 B（供應量為 100x）補充全量。不要更換培養基。
6. 收穫成熟的 moDC（第 7/8 天）。 用移液器上下移動幾次，將鬆散附著的細胞移開。將含有細胞的培養基移入 50 mL 管中。
7. 進行您的實驗。 重悬並計算細胞數量。moDCs現在可以用於您的實驗了。可選擇表徵其樹突狀細胞免疫表型，例如進行 CD14、CD45 和 CD83 的流式細胞分析。

方案 B：使用 DC 生成培养基和单核细胞附着培养基从新鲜分离的细胞中生成 moDCs

1. 让细胞附着（第 0 天）。 在適量的 PromoCell 單核細胞附著培養基 (C-28051) 中培養新鮮分離的細胞。以 2-3 百萬個/cm² 的密度接觸單核細胞，以 0.5 百萬個/cm²的密度接觸純化的單核細胞。在 5%CO₂ 和 37 °C的培養箱中培養 1 小時。
2. 清洗黏附細胞部分（第 0 天）。 用力攪拌組織培養容器，鬆動非黏附細胞並吸出 它們。用溫的 Monocyte Attachment Medium (C-28051)洗滌黏附細胞三次，攪動容器並吸出上清液。
3. 開始分化為未成熟的 moDC（第 0 天）。 加入適量的 PromoCell Dendritic Cell Generation Medium (C-28050) supplemented with 1x Component A of the Cytokine Pack moDC (supplied at 100x) and incubate for 3 days at 37 °C and 5% CO₂.
4. 更換培養基（第 3 天）。在第 3 天進行培養基更換：吸出細胞中的培養基並收集到離心管中。立即將新鮮的 PromoCell DC Generation Medium (C-28050) supplemented with 1x Component A of the Cytokine Pack moDC 加入細胞中。將試管中的細胞以 180 x g 離心 10 分鐘。丟棄上清液，小心地將細胞重懸於少量新鮮培養基。將試管中的重懸細胞與組織培養容器中新鮮培養基的細胞混合。
5. 完成 moDC 成熟過程（第 6 天）。 要完成 moDC 成熟過程，在第 6 天用 1x 的 Cytokine Pack moDC 的 B 組分（供應時為 100x）補充全量。不要更換培養基。在 37 °C、5% CO₂  下孵育 24-48 小時。
6. 收穫成熟的 moDC（第 7/8 天）。 用移液器上下移動幾次，將鬆散附著的細胞弄開。將含有細胞的培養基移入 50 mL 管中。
7. 進行您的實驗。moDCs現在可以用於您的實驗了。可選擇表徵其樹突狀細胞免疫表型，例如，進行 CD14、CD45 和 CD83 的流式細胞儀分析。

方案 C：從冷凍保存的細胞中產生 moDCs

若要從冷凍保存的外周血單核細胞中產生 moDCs，PromoCell 建議使用 Dendritic Cell Generation Medium (C-28050)。

1. 接種細胞（第 0 天）。 按照細胞隨附的說明書，在水浴中解凍保存的單核細胞。 解凍後，立即以 50 萬個/cm² 的速度將它們培養在適量的 PromoCell Dendritic Cell Generation Medium (C-28050)，並補充 1x Component A of the Cytokine Pack moDC (supplied at 100x)。每瓶冷凍保存的細胞至少使用 9 mL 培養基。
2. 更換培養基（第 1 天）。 吸出細胞中的培養基，收集於離心管中。立即移取新鮮的 PromoCell Dendritic Cell Generation Medium (C-28050) 補充 1x Component A of the Cytokine Pack moDC 至細胞中。將試管中的細胞以 180 x g 離心 10 分鐘。丟棄上清液，小心地將細胞重懸於少量新鮮培養基。將重懸的細胞與組織培養容器中新鮮培養基的細胞混合。再培養 3 天。
3. 換液 (第 4 天). 如上所述進行換液。在 37 °C、5% CO₂ 下再培養 2 天。
4. 完成 moDC 成熟過程（第 6 天）。 為了完成 moDC 成熟過程，在第 6 天用 1x 的 Cytokine Pack moDC B 組分（供應時為 100x）補充全量。不要更換培養基。在 37 °C 和 5% CO₂  下孵育 24 到 48 小時。
5. 收穫成熟的 moDC（第 7/8 天）。 用移液器上下移動幾次，將鬆散附著的細胞弄開。將含有細胞的培養基移至 50 mL 管中。
6. 進行您的實驗。 重悬並點算細胞。moDC現在可以用於您的實驗了。可選擇表徵其樹突狀細胞免疫表型，例如，進行 CD14、CD45 和 CD83 的流式細胞分析。

Results

A                                                                                 .nbsp;                                                              .nbsp;                   B

圖 2. 成熟單核細胞衍生的人類樹突狀細胞的 FACS 分析。成熟樹突細胞標記包括 CD83 的高表達和 CD14 的低表達。A. 在 PromoCell DC Generation Medium 中生成的第 8 天成熟 moDCs 的流式計數分析顯示，未成熟標記 CD14 呈陰性，而 DC 成熟標記 CD83 呈陽性。

圖 3.未成熟和成熟單核細胞衍生的人類樹突狀細胞的形態。 A) 第 6 天未成熟的單核細胞衍生樹突細胞 (moDCs)。注意在附著（中間）以及鬆散附著（左上）的細胞中看到的大胞質、紗幔狀突起。B) 第 8 天成熟的單核細胞衍生樹突細胞 (moDC)。注意這個非黏附細胞表面產生的多個樹突狀結構。

參考資料

1. Chung N, Chen Y, Chan V, Tam P, Lin C. 2005. Dendritic Cells: Sentinels of Immunity and Tolerance. Histol Histopathol. 19(1):317-24.

2. Kubach J, Becker C, Schmitt E, Steinbrink K, Huter E, Tuettenberg A, Jonuleit H. 2005. Dendritic Cells: Sentinels of Immunity and Tolerance. International Journal of Hematology. 81(3):197-203. https://doi.org/10.1532/ijh97.04165

3. Banchereau J, Palucka AK. 2005. Dendritic cells as therapeutic vaccines against cancer. Nat Rev Immunol. 5(4):296-306. https://doi.org/10.1038/nri1592

4. Ohnmacht C, Pullner A, King SB, Drexler I, Meier S, Brocker T, Voehringer D. 2009. Constitutive ablation of dendritic cells breaks self-tolerance of CD4 T cells and results in spontaneous fatal autoimmunity. 206(3):549-559. https://doi.org/10.1084/jem.20082394

5. Lo P. 2003. HIV hijacks dendritic cells. Nat Med. 9(6):650-650. https://doi.org/10.1038/nm0603-650