I.儲存
A.低溫保存小瓶 (104-05a, 104-05n)
低溫保存小瓶運抵後，請立即存放於液氮儲存槽中。
*從液氮儲存槽中取出低溫保存小瓶時，請務必戴上面罩和手套。從儲存槽到室內的劇烈溫度變化可能會導致冷凍瓶中滯留的液氮爆裂並造成傷害。
II.培養前的準備工作
- 確保具有 HEPA 過濾層流空氣的 II 級生物安全櫃處於正常工作狀態。
- 用 70% 酒精消毒生物安全櫃。
- 開始細胞培養工作前，將生物安全櫃的鼓風機打開 10 分鐘。
- 確保所有血清移液器、移液器吸頭及試劑溶液均為無菌。
- 遵循標準的消毒技術和安全規則：
a. 不要用嘴移液。請勿用口移液。
b．即使所有菌株的 HIV、乙型肝炎和丙型肝炎檢測結果均為陰性，在處理人類細胞時，務必戴上手套和安全眼鏡。
III.培養 HEM
A.準備培養 HEM 的細胞培養瓶
- 從冰箱中取出黑色素細胞生長培養基。
- 用移液管吸取 15 mL 黑色素細胞生長培養基*至 T-75 燒瓶中。
*保持培養基與表面面積的比例為每 5 cm2 1 mL。
例如：
5 mL 用於 T-25 燒瓶或 60 mm 組織培養皿。
15 mL 用於 T-75 燒瓶或 100 mm 組織培養皿。
B.解凍和接種半球
- 使用適當的眼睛和手部保護措施，從液氮儲存槽中取出冷凍保存的小瓶 HEM。
- 將小瓶蓋轉動四分之一圈，以釋放可能滯留在螺紋中的液氮，然後將蓋子重新鎖緊。
- 將小瓶的下半部放入 37 °C 水浴中快速解凍細胞，並在解凍過程中密切觀察小瓶。
- 當小瓶中只剩下少量冰時，從水浴中取出小瓶。不要讓細胞完全解凍。請勿用手觸摸瓶蓋邊緣或小瓶，以免污染。
- 用 2 mL 移液管輕輕地移動細胞 5 次，重悬小瓶中的細胞。
- 將細胞懸浮液（1 mL）從小瓶移入盛有 15 mL 黑色素細胞生長培養基的 T-75 燒瓶中。
- 蓋上瓶蓋，輕輕搖動，使細胞均勻分佈。
- 將 T-75 燒瓶放入 37 °C, 5% CO2 加濕培養箱中。鬆開瓶蓋以進行氣體交換。
- 24小時後或隔夜換上新鮮的 黑色素細胞生長液 ，以去除所有DMSO的痕跡。
- 隔天換一次 黑色素細胞生長液 ，直到細胞達到60%的融合度。
- 當培養達到 >60% 匯合或週末餵養時，加倍黑色素細胞生長液的用量。
- 當 HEM 培養達到 80% 匯合時，對細胞進行分培。
IV.亞培養 HEM
A.準備亞培養試劑
- 從 -20 °C 冷凍庫中取出胰蛋白酶-EDTA 溶液和胰蛋白酶抑制劑，並在冰箱中解凍過夜。輕輕攪拌每瓶試劑數次，以形成均勻的溶液。
- 將所有亞培養試劑保存在 4 °C，以備將來使用。
- 如果只需要一部分 胰蛋白酶/EDTA溶液 ，請將未使用的部分儲存於-20 °C。準備培養瓶
- 從冰箱中取出黑色素細胞生長培養基。
- 用移液管移取 30 mL 黑色素細胞生長培養基於 T-175 燒瓶中(用於第四節 C 步驟 15)。將細胞在室溫下進行胰蛋白酶(Trypsin)處理。
- 吸出培養瓶中的培養基。
- 用 HBSS 清洗單層細胞，吸出溶液。
- 用移液管吸取 5 mL 的 胰蛋白酶/EDTA 溶液 到 T-75 燒瓶中。
- 立即移除 4 mL 溶液。
- 重新蓋緊瓶蓋，在室溫下倒置顯微鏡下監測胰蛋白酶化的進程。細胞變圓通常需要 2 到 4 分鐘。在胰蛋白酶化過程中，細胞可能不會完全變圓，有些細胞即使從培養基表面鬆脫，仍可能保持一定的過程。
- 用手掌敲打瓶側，直到大部分細胞脫離，從培養基表面釋放圓形細胞。
- 用移液管移取 5 mL 的 胰蛋白酶抑制劑溶液 到瓶中，以抑制進一步的胰蛋白酶活性。
- 將培養瓶中的細胞懸浮液轉移到 50 mL 無菌錐形管中。
- 用另外 5 mL 的 胰蛋白酶抑制劑溶液 沖洗燒瓶，並將溶液轉移到同一個錐形管中。
- 在顯微鏡下檢查 T-75 燒瓶 。
- 將圓錐管以 220 x g 離心 5 分鐘，使細胞沉澱。
- 將上清液從管中抽出，不要打擾細胞沉澱。
- 用手指輕彈圓錐管的頂端，使細胞團鬆開。
- 將細胞重懸在 5 mL 黑色素細胞生長液中，用移液器輕輕地移動細胞，使其團塊破裂。
- 使用血球計或細胞計數器計數細胞。快速生長時接種 10,000 cells per cm2 ，定期分次培養時接種 6,000 cells per cm2 .
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