解凍細胞株

ECACC Laboratory Handbook

4th Edition

許多從培養物集（例如 ECACC ）獲得的培養物會冷凍送達，為了使用這些細胞，必須將其解凍並進行培養。正確解凍細胞對維持培養物的活力和使培養物更快復原至關重要。某些低溫保護劑（如 DMSO）在 4 °C 以上會產生毒性。

材料

• 細胞培養基：預先加熱至適當溫度（有關正確的培養基和溫度，請參閱 ECACC 細胞品系資料表。)
• 70% (v/v) 酒精在無菌水中 (793213)。li>DMSO (D2650)
• Trypan Blue Solution (T8154)

設備

• 個人防護裝備（無菌手套、實驗室外套、安全面罩）
• 運送冷凍安瓿的容器，如：
• 冷凍安瓿。g.例如：乾冰盒或液氮罐
• 設定適當溫度的水浴槽
• 適當密閉等級的微生物安全櫃
• 培養箱
• 預先標示的平底瓶
• 倒置相差顯微鏡
• 血球計 或自動細胞計數器，如 Scepter™ Cell Counter
• 離心機
• 標記筆
• 移液管
• 安培架
• 組織

程序

1. 閱讀細胞系資料表，以確定您的細胞系的具體要求。
2. 準備容量瓶：標上細胞系名稱、通過數和日期。
3. 穿戴適當的個人防護裝備，從液氮儲存中收集一安瓿細胞，並放入液氮容器或乾冰中轉移到實驗室。處理安瓿時務必小心：在極少數情況下，安瓿在加熱時可能會因滯留的殘餘液氮膨脹而爆炸。
4. 在微生物安全櫃中，用蘸有70%酒精的紙巾圍繞冷凍安瓿的瓶蓋，將瓶蓋轉動四分之一圈，以釋放可能滯留的殘餘液氮。重新鎖緊瓶蓋。快速將安瓿移至 37 °C 水浴中，直到只剩一、兩個小冰晶為止（1-2 分鐘）。快速解凍非常重要，以減少對細胞膜的任何損害。
5. 注意：請勿完全浸入安瓿，以免增加污染風險。
6. 在打開安瓿之前，用蘸有 70% 酒精的紙巾擦拭安瓿。
7. 用移液管將安瓿中的全部內容物移入無菌試管（例如： 15 mL 容量）中、15 mL 容量）。然後慢慢加入 5 mL 已經添加適當成份的預溫培養基。使用胰盤藍測定存活細胞密度。將適量的細胞懸液轉移到燒瓶中，以達到細胞系資料表上所建議的細胞種植密度。

8. 對於黏附細胞株：調整培養基的容量，必要時調整培養瓶的大小，以達到細胞系資料表上建議的細胞播種密度。通常不需要預先離心移除低溫保護劑的步驟，因為第一次更換培養基時會移除殘留的低溫保護劑。如果需要，則會在資料表中說明。如果要立即使用細胞（例如，用於以細胞為基礎的檢測），而不是進行培養，則建議執行預離心步驟以去除冷凍保護劑。
   
9. 對於懸浮細胞株: 建議進行預離心步驟以去除低溫保護劑，也就是說。
10. 在數據表建議的溫度和CO₂ 水平下培養。如果使用 CO₂ fed incubator，則培養瓶應具有通氣蓋，以便進行氣體交換。
11. 24 小時後，用顯微鏡（相對）檢查細胞，必要時進行亞培養。

重點

1. 大部分教科書建議用培養基清洗解凍的細胞，以去除冷凍保護劑。只有在已知低溫保護劑對特定細胞類型有不利影響時，才有必要這樣做。例如，已知某些細胞類型會在 DMSO 的存在下分化。
2. 將解凍的細胞懸液加入培養基，可有效稀釋低溫保護劑（如 DMSO），降低低溫保護劑的毒性。這就是為什麼在安瓿解凍後，必須立即將解凍的細胞懸液加入較大量的培養液中，切勿讓解凍的安瓿長時間放置在室溫下。
3. 請勿使用孵育箱或手掌來解凍細胞培養物，因為解凍速度太慢，會導致活力下降。
4. 如果沒有 CO₂  培養箱，請在 95% 的空氣中用 5% 的 CO₂  通過 0.2μm 過濾器。
5. 對於大多數培養物來說，最佳做法是在達到合併期之前進行亞培養，以便在細胞對數生長期收穫細胞，並使細胞處於最佳活力狀態，以便將細胞播種到新培養瓶中。
6. 有些雜交瘤在復甦後恢復較慢，因此開始時應在適當的培養基中加入 20% (v/v) FBS。

視訊教學：如何高效率地解凍細胞

觀看本教程，了解從冷凍存儲開始新鮮細胞培養的最佳做法、細胞解凍技巧，以及最大限度提高培養物存活率的訣竅。