反相 SPE 方法

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• SPE 提示

水性樣品基質/移動相環境

與正相或離子交換 SPE 相比，反相 SPE 被認為是選擇性最低的保留機制。換句話說，反相方法或接合化學可能難以區分結構相似的分子。不過，由於反相可以保留大部分具有任何疏水性的分子，因此對於萃取同一樣品中結構多樣的分析物非常有用。

圖 1. 水性樣品基質/移動相環境

反相萃取 (Revers-Phase SPE)反相 SPE
保留機制：	非極性或疏水相互作用
樣品基質：	水性樣品 生物體液（血清、血漿、尿液） 組織的水性萃取液 環境水樣品 葡萄酒、啤酒和其他水樣品
分析特性：	具有非極性官能性的分析物 大多數有機分析物 烷基、芳香族、脂環族官能基
洗脱方案：	以溶劑 或具有足夠非極性的溶劑混合物破壞反相作用 緩衝劑/溶劑混合物
常見應用：	生物液中的藥物和代謝物 水中的環境污染物 組織和固體的水性萃取物

基本步驟

1. 樣品預處理： 對於帶干擾的樣品 (如.g.,當處理可電離的化合物時，pH 值的控制可能很重要。
   
   當分析物處於中性狀態時，會變得更疏水，在反相條件下的保留能力會增強。將樣品 pH 調整到高於或低於化合物 pKa（取決於官能基）2 個 pH 單位，將有效中和化合物。處理組織和其他固體時，請使用緩衝液進行固液萃取或均質化。
   
   
   
   
   
   
   非極性溶劑（包括甲醇和異丙醇）會破壞化合物與吸附劑官能基之間的相互作用。
   
   為避免堵塞，在
   將樣品引入 SPE 相之前，可能需要對樣品進行離心、稀釋和/或預過濾。
   
   
2. 調理/校正： 調理濕潤或活化接合相，以確保分析物與吸附劑官能基之間的互動一致。反相吸附劑通常使用 1-2 管容量的水溶性溶劑（如甲醇或乙腈）進行調節。
   
   為了最大限度地保留樣品，平衡引入了一種在溶劑強度和 pH 值方面與樣品載荷相似的溶液。1-2 管容量的緩衝液（用於樣品前處理）或水是反相平衡的好選擇。
   
   
3. 樣品載量： 以 ~1-2 滴/秒的一致且較低的流速施加樣品（從步驟 1 開始），以確保最佳的保留效果。
   
   
4. 清洗： 在樣品載入過程中，樣品干擾物經常與相關化合物共存。洗滌步驟是必要的，以便在不過早洗出相關化合物的情況下洗出干擾物質。5-20% 甲醇水溶液或樣品前處理緩衝液是典型的洗滌溶劑。
   
   
5. 洗脱： 使用具有足夠非極性的有機溶劑或溶劑組合，破壞分析物與吸附劑官能基之間的疏水作用。
   
   在處理可電離的化合物時，洗脫過程中的 pH 值控制通常可以提高回收率。In their ionic form, basic and acidic compounds become more polar, weakening reversedphase interaction, possibly allowing for weaker elution solvents and/or reduced elution volumes.
   
   
6. 洗脱液後處理： 在進行 LC 分析之前，通常需要將 SPE 洗提液蒸發並重構成流動相。GC 分析通常需要進一步濃縮 SPE 洗提液和/或可能使用揮發性較高的溶劑進行基質交換。

SPE Tips

1. 在樣品前處理過程中，應破壞藥物與蛋白質的結合。
   策略包括：
   • 40 µL 2% EDTA 二鈉/每 100 µL 小鼠血漿
   • 40 µL 2% 甲酸/每 100 µL 小鼠血漿
   • 其他可能的試劑（每 100 µL 矩陣）：
     40 µL 2% TCA、40 µL 2% 醋酸、40 µL 2% TFA、40 µL 2% 磷酸或 200 µL MeCN（蛋白質 ppt.
   
   
2. 如果在分析前需要蒸發 SPE 洗提液，請在洗提後透過 SPE 管通入真空空氣約 10 分鐘。
   
   
3. 如果在分析前需要蒸發 SPE 洗提液，則在洗提後通過真空空氣約 10 分鐘，這樣可以去除可能延長蒸發時間的殘留水分。
   
   
4. 在樣品載入和洗提過程中，穩定而緩慢的流速（每秒 1-2 滴）可以提高回收率和重現性。
   
   
5. 減少床重以最小化洗脱量。
   
   
6. 增加床重以保留更多的極性化合物。
   
   
7. 只有在甲醇調節過程中，才需要關注吸附劑過乾的問題。
   
   
8. 在調節之前，可以使用預調節溶劑，如二氯甲烷（或用於洗滌的溶劑），以去除 SPE 管上任何可能干擾後續分析的雜質。