HybridSPE®-Phospholipid板可從血漿樣本中優異地回收這些難於分析的化合物，隨後在Ascentis® Express Fused-Core® C18 色譜柱上進行LC/MS/MS分析。萃取物不含可能干擾定量、降低樣品處理量和減少色谱柱壽命的內源磷脂。
引言
由於種種原因，將某些臨床方法從免疫分析轉換為 LC/MS/MS 的趨勢日益明顯。LC/MS/MS 可提高檢測的特異性，不受抗體可用性的限制，並允許同時進行多重分析檢測。然而，LC/MS/MS 也不是沒有其限制，最明顯的是來自內源樣品基質的干擾，這可能會導致分析反應中看似隨機和任意的區別，以及其他影響1.
。研究目的
本研究的目的有二。首先，開發一種簡單的 LC/ MS/MS 方法，包括使用 HybridSPEP 磷脂板製備樣品，用於直接分析血漿中的類固醇激素孕酮、醛固酮、皮質酮、去氧皮質酮、睾酮和 17α-甲基睾酮。其次，比較結果樣品預備方法與標準蛋白沉澱樣品之間來自樣品基質的背景。
實驗
色譜 (LC/MS/MS) 條件
類固醇激素的化學結構如 圖 1所示。使用類固醇激素混合物進行初步評估，以建立 Ascentis Express C18 色譜柱的色譜條件。擴展梯度譜，以便對處理過的血漿進行基質監測
圖 1. 類固醇荷爾蒙的結構
HybridSPE-Phospholipid操作原理
HybridSPE-Phospholipid技術結合了蛋白質沉澱的簡單、標準化方法與固相萃取的特異性，可同時去除生物樣品中的蛋白質和磷脂質。該技術以氧化鋯-矽石混合顆粒為基礎，可針對性地分離磷脂，而 PTFE 熔塊材料則作為深度過濾器，可有效去除沉澱的蛋白質顆粒。混合顆粒的氧化鋯部分表現為路易斯酸（電子接受者），可與路易斯碱（電子供給者）產生強烈互動，例如磷脂的磷酸分子。
樣品前處理方法開發：
樣品前處理方法開發：影響分析物回收率的因素
樣品前處理方法開發包括從HybridSPE-磷脂96孔板中建立標準化合物的回收率，然後將這些條件轉移到加標血漿樣品中使用。方法最佳化包括評估幾種沉澱溶劑系統。一旦血漿樣本確立了足夠的分析物回收率，研究的最後部分就是比較HybridSPE-Phospholipid技術和常用的蛋白質沉澱法來去除磷脂基質。
使用 HybridSPE-Phospholipid 從標準溶液中回收分析物質
使用 HybridSPE-Phospholipid 96 孔板進行方法開發，首先從標準溶液中建立六種類固醇的回收率。在 1%(v/v)甲酸乙腈:水(3:1)中建立了每種化合物 10 至 300 ng/mL 的外標校正曲線。將 300 µL 等分的標準溶液（50 ng/mL）加入 HybridSPE-Phospholipid 96 孔板中。在 10" Hg 下抽真空 4 分鐘。
使用 HybridSPE-Phospholipid 從血漿中回收分析物質
HybridSPE-Phospholipid 用於血漿樣品沉澱的主要溶劑是乙腈中的 1% (v/v) 甲酸。此溶液與血漿樣品以 3:1 的比例使用，可有效沉澱血漿蛋白質。甲酸還能破壞目標分析物與蛋白質的結合，提高靈敏度。然而，對於具有螯合特性的分析物質，在乙腈中使用 0.5% (w/v) 的檸檬酸作為沉澱添加劑，並在預先處理步驟中使用，可大幅增加這些分析物質從氧化鋯-二氧化矽微粒中的回收率。
甲酸系統： 1% (v/v) 甲酸乙腈：水 (3:1)
用 K2EDTA (Lampire Biological Laboratories, Pipersville PA) 穩定的大鼠血漿從標準溶液中添加分析物質。將 100 µL 等分樣本加入 HybridSPE-Phospholipid 板中，再加入 300 µL 1%甲酸乙腈沉澱溶劑。通過渦輪攪拌平板 4 分鐘，然後將其放置在真空歧管上，並在 10" Hg 真空下抽真空 4 分鐘。收集濾液後直接進行分析。最終樣品中類固醇激素的濃度相當於 50 ng/mL。
檸檬酸系統： 0.5% (w/v) 檸檬酸於乙腈中，用於螯合化合物
檸檬酸程序與上述甲酸程序相同，除了這兩個步驟：沉澱溶劑為乙腈中的 0.5% (w/v) 檸檬酸。
監測血漿樣品基質中的磷脂
使用0.5%檸檬酸乙腈沉澱加標血漿樣品，並直接進行分析。使用 Q3 全掃描及 104 m/z 前體離子掃描進行磷脂質監測。利用梯度色譜條件進行分析，可在高有機條件下洗脫磷脂。
結果與討論
六種類固醇激素在Ascentis Express C18上的梯度洗脫與LC/MS/MS檢測結果如 圖2所示。
圖 2. 類固醇激素的 LC/MS/MS 分析
條件
色譜柱： Ascentis Express C18, 10 cm x 2.1 mm I.D.、2.7 µm（產品編號 53823-U）; 移相： （A）5 mM 甲酸銨，pH 4.0 with formic acid; (B) methanol; gradient: 60% B for 3 min, to 95% B in 5 min, held at 95% B for 2 min; flow rate: 0.3 mL/min; column temp: 50 °C; pressure: 90 bar detector： ESI(+)，MRM; 進樣： 2 µL; 樣品： 每種化合物50 ng/mL; 系統： 島津 LC-30AD、LCMS-8030
分析回收率
表 1
在甲酸系統中，使用標準溶液觀察到醛固酮、皮質酮和去氧皮質酮的回收率低且變異性大。這是由於這些分子上的結合羰基/羧酸位點與 HybridSPE- 磷脂微粒的氧化鋯-二氧化矽表面螯合所致。醛固酮和孕酮的結構可以在 圖1中進行比較。注意羰基和羥基的位置使醛固酮具有螯合傾向。與標準溶液相比，預期從血清或血漿中提取 HybridSPE 磷脂時，分析物的回收率會更高。这是因为磷脂在血浆样品中含量很高，它们与HybridSPE-磷脂颗粒上的路易斯酸氧化锆分子相互作用很强，从而掩盖了敏感分析物的这些位点。表1B 支持这一前提；从血浆中提取的皮质酮和脱氧皮质酮的回收率和变异性比提取水标准溶液时显著提高。
用檸檬酸取代甲酸，可以克服螯合現象。檸檬酸是一種螯合劑，當作為 HybridSPE-Phospholipid 的添加劑使用時，它可以綁住氧化鋯表面。表 1C 顯示使用檸檬酸作為沉澱添加劑以及預先條件步驟，可大幅增加 HybridSPE-Phospholipid 微粒中螯合化合物的回收率與再現性。
監測共萃取磷脂基質
圖3 顯示了HybridSPE-磷脂技術和蛋白沉澱技術的基質監測色譜圖。與標準蛋白沉澱技術相比，使用HybridSPE-磷脂技術處理的血漿樣品沒有檢測到基質干擾。雖然來自標準蛋白沉澱技術的磷脂基質沒有直接與目標分析物共同沉澱，但仍會造成 MS 源的堵塞。磷脂基質會導致色譜攜帶到後續樣品中，造成隨機干擾和潛在的色譜柱故障。
圖 3. 監測共萃取磷脂基質
條件
色譜柱： Ascentis Express C18, 10 cm x 2.1 mm I.D.、2.7 µm（產品編號 53823-U）; 移相： （A）5 mM 甲酸銨，pH 4.0 with formic acid; (B) methanol; gradient: 60% B for 3 min, to 95% B in 5 min, held at 95% B for 2 min; flow rate: 0.3 mL/min; 柱溫： 50 °C; 壓力： 90 bar
探測器： ESI(+), MRM; injection： 2 µL; 樣品： 每種化合物50 ng/mL; 系統： 島津LC-30AD, LCMS-8030
摘要
在HybridSPE-磷脂板上使用0.5%檸檬酸乙腈系統，可從血漿樣本中獲得極佳的分析物回收率和高效的磷脂去除率。這項研究顯示，面對特別困難的分析物時，可以採取簡單有效的方法。在本文介紹的例子中，最初在甲酸系統中螯合類固醇化合物的回收率很低，但使用消除了螯合作用的檸檬酸系統後，回收率得到了改善。該方法對標準溶液和加標血漿樣本中的所有受測類固醇化合物均具有高回收率和低變異性。檸檬酸系統在去除基質中的內源性磷脂方面也非常有效。總之，HybridSPE-Phospholipid 對一般方案稍作修改後，便可有效減少基質，同時提供高難度、螯合分析物的優異回收率。HybridSPE-Phospholipid 是一種簡單有效的 LC/MS 樣品前處理技術，可降低生物樣品 LC/MS 分析中的基質效應。
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