介紹BIOshell™ Fused-Core® U/HPLC色譜柱
摘要
BIOshell™ Fused-Core® U/HPLC色譜柱
背景與特性
Fused-Core®U/HPLC色譜柱的開發是基於J.E. I. du Pont de Nemours 公司的 J. Kirkland 在 20 世紀 60 年代末 HPLC 成長期開發的漿狀二氧化矽技術，並應用於本世紀製造 2.7 至 5 微米範圍內的高效顆粒1,2。從這項技術衍生出來的最新創新技術，現在可做為 BIOshell™ Fused-Core® 色譜柱，用於更快速的蛋白質和多肽液相色譜 (FP2LC) 分離。用於多肽分析的 BIOshell™ 色譜柱使用 2.7 或 5 微米的顆粒填料，這些顆粒含有 160 Å 孔隙，並與 C18 烷基或烷基氰基官能團結合；而使用含有 400 Å 孔隙並與 C4 烷基官能團結合的 3.4 微米顆粒進行蛋白質分離效果最佳。
2007年，Supelco推出了具有突破性的Ascentis® Express Fused-Core® 色谱柱系列，用于分析低分子质量的化合物。在接下來的幾年裡，很明顯的：(a) 以 2.7 微米、90 Å 孔徑的多孔殼纖維微粒填裝的色譜柱，在色譜柱效率上有顯著且意想不到的改善，可媲美以全多孔纖維微粒填裝的 1.7 微米的顆粒，而且 (b) 理論家的思想必須進行范式轉換，以調整色譜帶擴展理論，從而解釋在此之前被認為不可能實現的色譜柱效率3,4 。
與 Ascentis® Express 色譜柱中的顆粒一樣，BIOshell™ 色譜柱中的顆粒也是由球形固體玻璃核心組成，四周圍繞著一層薄薄的奈米級矽膠顆粒。 Table 1 總結了新型 BIOshell™ 多孔殼柱的特性和最大工作條件。
如 表 1所示，為了適應更大尺寸的生物聚合物，BIOshell™色譜柱的顆粒具有 160 Å 孔隙，可讓質量達到約 20 kDa 的多肽無障礙地進入，或具有 400 Å 孔隙，可讓分子質量達到約 500 kDa 的蛋白質無障礙地進入。請注意，與相同尺寸的全多孔顆粒相比，多孔殼的厚度不同，表面面積的百分比也不同。因此，3.4 微米顆粒的 0.2 微米殼所產生的表面面積是該尺寸全多孔顆粒的 31%。同樣地，2.7 微米顆粒的 0.5 微米外殼可提供 75% 的最大表面面積，而名義上 5 微米、實際上 4.7 微米顆粒的 0.6 微米外殼則包含 59% 的全多孔顆粒表面面積。儘管表面面積的損失似乎令人擔心，但Ungeret al.首先證明即使是無孔基材也能充分保留較大的生物分子，而Gritti和Guiochon則顯示即使是大型生物聚合物，核殼顆粒的容量也不會大幅減少，最近Guillaumeet al的一篇論文也證實了這個結論。，他們發現寬孔核殼柱的負載能力比全多孔柱低 2-3 倍5-7 。
表 1 還顯示了粘合相特性、推薦 pH 值範圍，以及每種顆粒類型進行測試時背壓和溫度的最高值。雖然 600 bar 或 9,000 psi 的最高壓力在當今的 UHPLC 系統中看似不高，但 80-100 °C 的最高操作溫度卻提供了非常有益的自由度，尤其是在處理包括單克隆抗體在內的較疏水性蛋白質時，這將在下面的證明陳述中說明。
Table 1.BIOshell™ Fused-Core® 列的特性和操作條件
| Dp (µbm) | Core (µm) | Shell (µm) | Pore Size (Å) |
SBET (m2/g) | 容量 vs. 多孔性 | 濾網 (m2/g) | |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 2.7 µm A160 Peptide C18 | 2.7 | 1.7 | 0.5 | 160 | 80 | 75% | |
| 2.7 µm A160 多肽 CN | 2.7 | 1.7 | 0.5 | 160 | 80 | 75% | |
| 4.7 | 3.5 | 0.6 | 160 | 60 | 59% | ||
| 5 µm A160 Peptide CN | 4.7 | 3.5 | 0.6 | 160 | 60 | 59% | |
| 3.4 µm A400 蛋白質 C4 | 3.4 | 3.0 | 0.2 | 400 | 15 | 31% |
| Physical Parameter | Bonded Phase Ligand | End Capped | Tmax °C | Pmax (bar) | Frit (µm) | ||||||
| 2.7 µm A160 Peptide C18 | di-isobutyl-octadecylsilane | No | 100 | 1-8 | 600 | 2 | |||||
| 2。7 µm A160 多肽 CN | 90 | 1-8 | 600 | 2 | |||||||
| 5 µm A160 Peptide C18 | di-isobutyl-octadecylsilane | No | 100 | 1-8 | 600 | 2 | |||||
| 5 µm A160 Peptide CN | Yes | 90 | 1-8 | 600 | 2 | ||||||
| 3.4 µm A400 蛋白質 C4 | 90 | 2-9 | 600 | 2 | |||||||
圖1 中的色譜圖顯示了IgG2-B亞型單克隆抗體在8 M胍基鹽酸中用100 mM二硫蘇糖醇（DTT）在50 ℃下溶解並還原硫化鍵35分鐘後的分析結果。 圖 1 中的主要成分是 IgG2-B 的輕鏈 (LC) 和重鏈 (HC)。插圖清楚顯示重鏈峰附近的幾個預期變異，不過次要峰的身分尚未確認。分析在 80 °C 下進行，是根據 Dillon 與 Amgen 的合作者的結果，最近其他研究小組也證實了這些結果8-11.
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圖 1.使用 10 cm x 2.1 mm 內徑的 BIOshell™ A400 Protein C4 色譜柱進行 IgG2-B 抗體片段的高溫分析
條件： 色譜柱： BIOshell™ A400 Protein C4, 10 cm x 2.1 mm I.D.、3.4 µm (66825-U); mobile phase: A: water:0.1% TFA, B: 乙腈:水:0.1% TFA, 80:20; gradient: 33-40% B in 10 min; flow rate: 0.25 mL/min; temp: 80 °C; detection： 280 nm; injection: 1 µL; sample: 0.5 mg/mL IgG2-B 用 100 mM DDT in 8 M guanidine HCl 在 50 ℃ 處理 35 分鐘; 儀器： Shimadzu™ Nexera®
另一個需要在高溫下操作反相柱的例子在 圖 2中提供了另一個需要在高溫下操作反相柱的例子，其中使用了所謂的中間向下（而非自上而下或自下而上）的方法來分析單克隆抗體的結構。在中間向下的方法中，IgG 在進一步表徵之前會被消化成幾個大的片段。新型蛋白水解酶 IdeS（市售品名為 FabRICATOR®）可將抗體裂解為 F(ab')2 和 scFc 片段，其分子質量分別約為 100 kDa 和 25 kDa。使用二硫還原法可將 F(ab')2 片段進一步分離為輕鏈 (LC) 和 F(ab) 兩種成分。
Figure 2 中所示結果的目視檢查顯示，在 90 °C 下運行時，BIOshell™ A400 Protein C4 色譜柱 (A) 的峰寬比使用全多孔 3.5 微米顆粒填料的競爭色譜柱 (B) 更窄，峰形更好。從另外兩種競爭色譜柱（C 和 D）的結果也可得出相同的結論，這兩種色譜柱的操作溫度為 80 °C，是製造商建議的最高溫度。在 90 °C 下操作 BIOshell™ A400 蛋白 C4 色谱柱的能力为参与抗体类生物治疗药物开发和分析的生物化学家提供了有益的灵活性。
圖 2.在最高建議溫度下使用寬孔反相柱分析抗體片段
條件： 色譜柱： 如所示，10 cm x 2.1 mm; 移動相 A： 80：20，（水，0.1% TFA）：（乙腈，0.1% TFA); Mobile phase B: 50:50, (water, 0.1% TFA) : (acetonitrile, 0.1% TFA）; 梯度： 30 至 70% B，12 分鐘; 流量： 0.3 mL/min; column temp. 柱溫： 按指示； 檢測： UV, 215 nm； 進樣： 1 µL，样品在流动相 A 中稀释后
为了确定使用大孔 Fused-Core® 颗粒填料的色谱柱在高温和高流速下持续运行的稳定性，在 10 cm x 2.1 mm I.D. BIOshell™ A400 Protein C4色谱柱。結果顯示於 圖 3 實驗中的第一次和最後一次進樣，其中色譜柱在流速 0.5 mL/min、溫度 90 °C 的條件下，在 25% 至 40% 乙腈/0.1%三氟乙酸 (TFA) 水溶液中重複進行 10 分鐘梯度進樣。在酸性（pH ~ 2.0）條件下，色譜柱於 90 °C 接觸近 15,000 個梯度柱容量（1 CV ~ 0.2 mL）後，觀察到所有蛋白質都有明顯但輕微的保留損失。需要注意的是，在實驗過程中，測試蛋白質的峰形和峰寬都沒有發生變化，這表明 BIOshell™ Fused-Core® 色譜柱具有極佳的物理穩定性。
圖 3.BIOshell™ A400 蛋白質 C4：色柱穩定性
PEAK IDs： 1. 細胞色素 c（12.4 kDa）; 2. 溶菌酶（14.3 kDa）; 3. 肌紅蛋白（17 kDa）; 4. 催化酵素（共250 kDa；四聚体各~60 kDa）; 5. 烯醇化酶（共93 kDa；二聚体各46.7 kDa each）
條件： 色譜柱： BIOshell™ A400, 10 cm x 2.1 mm 3.4 µm (66825-U); mobile phase A: water:0.1% TFA; 流动相B： 乙腈：0.1% TFA; 梯度： 25-40% B in 10 min; 流速： 0.5 mL/min; column temp: 90 °C; detection: 215 nm; injection: 1.0 µL; Instrument： Shimadzu Nexera
在最後一個例子中， 圖 4 ® 顆粒的孔徑較小，因此調整了梯度時間，使每個色譜柱接觸相同數量的梯度柱，在此例中為 46。從整個色譜圖（圖 4）中提取約 20 個峰作為代表性樣本，使用公認定義 Pc = 梯度時間/平均峰寬計算每個色譜柱的峰容量 (Pc)。表 2 列出了梯度時間（tg）和平均肽峰寬度（w）的實驗值，以及每根柱上該特定分離的計算峰容量。7 µm BIOshell™色谱柱的峰容量比5微米Zorbax 300SB-C18多孔色谱柱提高了40%，这与Gilar et al获得的结果一致。
12.12.
12.
圖 4.商用熔核®和全多孔反向色譜柱處理多肽消化混合物的峰容量
條件： 色譜柱： 如所示，15 cm x 2.1 mm; 流动相A: 0.1 %甲酸; 流动相B: 25:75, (0.4 % formic acid）:乙腈; 梯度: 如所示（以柱容量計）; 流速: 如所示; 柱溫.： 35 °C; det.ESI(+)-TOF; 注入： 2 µL; sample: 10 pmol / µL
表 2. 計算的峰值容量 |
|---|
結論
使用具有窄粒度分佈的多孔殼粒子來分析小分子量化合物所帶來的進步（可商業化為 Ascentis® Express 色譜柱），已擴展至肽和蛋白質的反相 U/HPLC 分析。正如預期和已經證明的，孔徑較大的 BIOshell™ Fused-Core® 色譜柱在單位壓降效率方面具有優勢，可以通過增加峰容量來利用這些優勢，也可以通過縮短分析時間來換取這些優勢，這些優勢可以用縮略語 FP2LC 或 Faster Peptide and Protein Liquid Chromatography 來概括。
商標
Fused-Core® 是 Advanced Materials Technology, Inc.LLC
BIOshell™ 是 Sigma-Aldrich Co.LLC
FabRICATOR®是Genovis AB的註冊商標
Shimadzu®和Nexetra® 是 Shimadzu Corporation 的註冊商標
鳴謝：
作者感謝 Stephanie A.Schuster和應用材料技術公司的Robert E. Moran提供圖1和圖3。
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