樣品處理祕訣 | MILLIPLEX^® 分析法

正確的樣品處理和製備對於運行免疫分析至關重要。從樣品的收集與儲存，到樣品稀釋的要求，每一個步驟都是為您的研究取得最佳結果的關鍵。大多數的MILLIPLEX^®試劑盒已通過血清、血漿和細胞培養上清的測試，本快速指南概述了準備這些樣品類型以用於MILLIPLEX^®多重分析的最佳做法。

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• 一般樣品製備與處理技巧
• 血清準備
• 細胞培養上清液製備
• 外周血單核細胞 (PBMC) 製備
  • 尿液分析a href="#urine-preparation「>尿液準備
  • MILLIPLEX需要特殊樣品製備的試劑盒
  • 使用其他樣本類型的協議
  • 請求資訊

一般樣品製備與處理技巧

• 避免對您的樣品進行多次冷凍/解凍循環。
  • 如果您可以選擇使用血清或血漿，我們建議您選擇血清，因為血清往往比較乾淨。
  • 建議使用渦旋法進行均勻的樣品預備。
  • 正確一致的移液技術是獲得準確數據的關鍵，尤其是當多個使用者將共同生成數據時。
    • 保持適當校準的移液器非常重要，而進行移液最佳實踐培訓可大幅提高移液精度。
    • 使用反向移液來獲得更精確的分液。 請參考頁面頂端的視訊來學習這項技術。
  • 遵循 MILLIPLEX^® 方案指示進行樣品處理和稀釋。
  • 某些用於代謝生物標誌物的MILLIPLEX^®試劑盒需要在樣品中添加蛋白酶和/或磷酸酶抑制劑。
  • 其他MILLIPLEX^®試劑盒可能需要樣品提取或酸化。

血清製備

• 建議使用血清分離管（SST）進行更高品質的分離。
• 在以 1,000 x g 離心 10 分鐘以分離細胞前，讓血液凝結至少 30 分鐘。
• 移除血清並立即執行檢測，或等分樣本並儲存於 -20° 至 -80°C 之間。
• 溶血可導致蛋白水解活性增加，分析物降解，主要是由於裂解細胞釋放的酵素所致。
  • 使用蛋白酶抑制劑收集的樣品中的微量溶血可能是可以接受的，但嚴重溶血可能會干擾檢測性能。
  • 如果您必須使用嚴重溶血或脂血的血清，請避免使用碎屑、脂質和細胞。
• 已知血紅蛋白（10 mg/mL）會干擾抗原/抗體的相互作用。
• 根據特定的 MILLIPLEX^® 試劑盒方案稀釋樣品。

血漿準備

• 建議使用 EDTA 作為抗凝劑收集血漿。
• 使用肝素作為抗凝劑時必須小心，因為肝素過量會提供假性高值。
  • 每毫升採血使用不超過 10 IU 的肝素。
• 其他抗凝劑尚未經過廣泛測試，因此不建議使用。
• 採血後 30 分鐘內以 1,000 x g 離心 10 分鐘。
• 立即移除血漿並進行檢測，或等分樣本並儲存於 -20° 至 -80°C。
• 根據特定的 MILLIPLEX^® 試劑盒方案稀釋樣品。

細胞培養上清液製備

• 將樣品離心以除去碎片並立即進行化驗，或等分樣本並儲存於 -20°C 至 -80°C。
• 對於細胞培養上清液，在空白、標準曲線和對照中使用新鮮的培養基作為基質溶液。
• 如果使用細胞培養基作為基質溶液，請確定其中不含活性蛋白酶、磷酸酶或補充劑，這些物質可能會干擾檢測或產生不準確的結果（例如：細胞因子、人血清）、
• 如果樣品在檢測緩衝液中稀釋，請使用檢測緩衝液作為基質。
• 某些試劑盒可能有特定要求，請在計劃實驗前務必參閱試劑盒協議。

外周血單核細胞 (PBMC) 製備

注意：PBMC 樣品製備是獲得重複性結果的最關鍵步驟。

• 裂解緩衝液中使用強力去垢劑。裂解緩衝液中需要足夠的去垢劑來溶解蛋白質。總蛋白濃度不要超過 5-6 mg/mL。
  • 使用總蛋白濃度為 >6 mg/mL 的 PBMC 樣品時，已觀察到多種分析物質的信號下降（未加入足夠的裂解緩衝液以溶解蛋白質）。
• 由於裂解緩衝液中使用了強洗滌劑，因此裂解液樣品需要在檢測緩衝液中進行足夠的稀釋以稀釋強洗滌劑。
  • 如果裂解液蛋白濃度低於 2 mg/mL，則測試中會出現過多含有強洗滌劑的裂解緩衝液，導致信號降低。
  • 如果蛋白濃度低於 2 mg/mL是無法避免的，我們建議使用較少的樣品，從而將測試中存在的裂解緩衝液量降至最低。
• 最佳總蛋白濃度為 2-6 mg/mL。使用 PBMC，我們確定每 100 萬個 PBMC 細胞使用 10 μL 的裂解緩衝液可產生約 2 mg/mL。加入 10 μL 此 2 mg/mL 樣品加上 15 μL 分析緩衝液可得到良好的結果。作為起點，建議每 200 萬個 PBMC 細胞加入 10 μL 溶劑緩衝液。
  • 切勿在溶劑緩衝液中稀釋樣品，而應在不含強去垢劑的檢測緩衝液中稀釋。

PBMCs的簡短方案

1. 如果PBMCs來自冷藏庫存，建議讓細胞在完整的培養基中恢復24小時。(在恢復 24 小時後，使用適當的細胞計數器進行細胞計數。
2. 在室溫下使用台式離心機以 1,000 x g 離心 5 分鐘。
3. 移去上清液，用 PBS 洗細胞。
4. 使用台式離心機在室溫下以 1,000 x g 離心 5 分鐘。
5. 移去洗滌緩衝液，每 200 萬個細胞加入 10 μL 裂解緩衝液（使用前加入 2 倍濃縮蛋白酶抑制劑）。
6. 將細胞裂解液移入離心管前，輕輕攪拌 30 秒。
7. 將清澈的上清液轉移到新的離心管中。
8. 建議至少在第一次使用時，先測定總蛋白濃度。如果沒有，則建議從 10 μL 樣品 + 15 μL 分析緩衝液 1 開始進行裂解液滴定，並在分析緩衝液 1 中進行 1:1 系列稀釋。在 「自製 」的裂解緩衝液中加入蛋白酶抑制劑（例如 AEBSF）和/或磷酸酶抑制劑。

有關總蛋白濃度和 MILLIPLEX^® 溶劑緩衝液的更多細節，請下載我們的 尿液準備

通常，測量尿液中的分析物質需要收集 24 小時尿液或收集第二次晨間排空的尿液。對於第二次晨間排空的尿液，分析物的值會以肌酸酐為標準，也就是說，分析物會以單位/毫升來表示、

• 將樣本短暫離心，以去除殘渣。
• 使用冷凍樣本時，建議完全解凍樣本，攪拌均勻，並在使用前離心，以去除微粒。試劑盒中提供的 Assay Buffer 應用作樣品稀釋液。

需要特殊樣品製備的MILLIPLEX^®試劑盒

表1描述了某些MILLIPLEX^®多重試劑盒所需的特殊樣品製備。

注意事項

1. DPP-IV (產品編號 DPP4-010)使用量為每毫升血液 10 µL。Pefabloc 或 AEBSF (產品編號 101500)在血液中的使用量為 1 mg/mL。
3.蛋白酶抑制劑雞尾酒 I (產品編號 20-201).
4.Protease Inhibitor Cocktail (產品編號 P2714)。

Table 1. MILLIPLEX^® kits requiring special sample preparation including the specific sample type and treatment/inhibitor.

使用其他樣本類型的方案

除了已在 MILLIPLEX^® 試劑盒中測試過的樣本類型外，還提供其他樣本類型的方案。表 2 中描述了一些示例。

有關 MILLIPLEX^® 面板的完整樣品類型資訊清單，請參閱 Tips & Tricks 手冊。

索取資訊

有興趣了解更多關於 MILLIPLEX^® 多重檢測的資訊嗎？請查看我們的常見問題或填寫以下表格。

僅供研究使用。不可用於診斷程序。