说明
本实验方案可用于测定核糖核酸酶A(RNase A)的活性。分光光度测量法(Spectrophotometric Stop Rate Determination)[300 nm处的吸光度(A300)，光程= 1cm]基于以下反应：
RNase A
核糖核酸 + 水 –––––––––––> 寡核苷酸
单位定义：在pH 5.0、25 °C条件下，每分钟使E0 – Ef的值下降100%的核糖核酸酶A量定义为一个酶活单位。
注意事项
请参阅产品化学品安全技术说明书，获取危害和安全操作方法相关信息。
所需试剂和设备
制备说明
使用超纯水（25 °C时≥18 MΩxcm电阻率）制备试剂。
缓冲液（100 mM乙酸钠，pH 5.0，25 °C）— 使用三水乙酸钠（货号S8625）在超纯水中配制13.61 mg/mL溶液。用 2 M乙酸调至pH5.0(25 °C) 。
RNA溶液[0.1% (w/v)核糖核酸溶液] — 使用核糖核酸（货号R6750）在缓冲液中制备~1 mg/mL溶液。摇动或颠倒确保溶解。切勿使用搅拌棒。溶解最多可能需要30分钟。RNA溶解后，在开始检测前务必先核对RNA浓度。在3.0 mL一次性丙烯酸酯比色皿中加入下列试剂并颠倒混匀：
ΔA300底物 = A300底物 – A300空白。ΔA300底物值必须在0.73±0.025之间，根据需要用适量的缓冲液或固体核糖核酸调节吸光度值。
酶溶液（RNase溶液）— 在冷的超纯水中配制50–75 Kunitz单位/mL的RNase储液。
- 总水解测定(Ef) — 用冷的超纯水将RNase储液稀释至终浓度0.50–0.75 Kunitz单位/mL的溶液。
- 速率测定(E0) — 临用前配制，用冷的超纯水将RNase储液稀释至终浓度0.20-0.30 Kunitz单位/mL的溶液。
操作流程
总水解测定(Ef)
在3.00 mL反应液混合物中，最终浓度为50 mM乙酸钠、0.05%（w/v）RNA和0.75-1.13 Kunitz单位的RNase A。
1.在3.0 mL一次性丙烯酸酯比色皿中加入下列试剂。准备三份平行试样。倒置混合。
2.将适宜的温控分光光度计平衡至25 °C，用空白皿调零。
3.每隔1分钟监测试样皿的A300吸光度值，持续约120分钟，或至ΔA300/min ≤0.002。当速率维持5分钟不变时，底物彻底水解。
4.三份平行试样的最终吸光度值的一致性应达90%。
速率测定(E0)
在3.00 mL反应液混合物中，最终浓度为50 mM乙酸钠、0.05%（w/v）RNA和0.04–0.06 Kunitz unit的RNase A。
1.分光光度计设为25 °C，空白皿调零，按总水解测定(Ef)步骤1准备试样。
2.在3.0 mL一次性丙烯酸酯比色皿中加入下列试剂：
3.颠倒混匀，在分光光度计中平衡至25 °C。
4.然后添加：
5.立即颠倒混匀，每隔1分钟记录A300的下降，至少记录10分钟。
底物污染测定
1.在3.0 mL一次性丙烯酸酯比色皿中加入下列试剂并颠倒混匀：
2.ΔA300底物 = A300底物 – A300空白。
3.ΔA300底物与RNA浓度核对值（见制备说明节的RNA溶液）的差异必须在20%以内，检测才有效。差异>20%代表RNA底物被污染。
结果
计算
1.
绘制ln(E0 – Ef)对时间（分钟）的曲线，测定斜率。
| 斜率 = | Δln(E0 – Ef) |
| Δt |
2.
| Kunitz单位/mL 酶 = | –(斜率) (3) (df) |
| (mL，酶 ) |
式中：
3 = 检测总体积 (mL)
df = 稀释倍数
mL，酶 = 第4步速率测定(E0)中加入的酶溶液体积
3.
| Kunitz单位/mg 固体 = | Kunitz单位/mL 酶 |
| mg固体/mL酶 |
参考文献
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