α-胰凝乳蛋白酶的酶学测定程序（EC 3.4.21.1）

描述

本操作程序可用于使用N-苯甲酰基-L-酪氨酸乙酯（BTEE）作为底物测定α-胰凝乳蛋白酶活性。它不适用于测定α-胰凝乳蛋白酶琼脂糖（货号C9134）。本方案是基于以下反应的连续分光光度速率测定（A₂₅₆，光程= 1 cm）方案：

式中：
BTEE - N-苯甲酰基-L-酪氨酸乙酯

单位定义 — 一个单位的α-胰凝乳蛋白酶在pH7.8、25℃条件下每分钟水解1.0 μmole的BTEE。

所需试剂和设备

Trizma^®碱（货号T1503）

N-苯甲酰基-L-酪氨酸乙酯（货号B6125）

甲醇（货号M1775）

氯化钙二水合物（货号C3881）

盐酸水溶液（货号H9892）

注意事项 — 有关有害物及其安全处理方法的信息，请参阅安全数据表。

制备说明

使用超纯水（25°C时 ≥ 18 MΩ×cm）制备试剂。

缓冲液（80 mM Trizma碱缓冲液，pH7.8，25 ℃）— 用超纯水和1.0 M Trizma碱缓冲液原液（货号T1503）制备12.5倍稀释液。在25°C下用1 M HCl或1 M NaOH将pH调节至7.8。

BTEE溶液（1.18 mM N-苯甲酰基-L-酪氨酸乙酯）— 制备100 mL：

• 称取37.0±0.5 mg N-苯甲酰基-L-酪氨酸乙酯（货号B6125）置入100 mL A级容量瓶中。
• 加入63.4 mL甲醇（货号M1775）并涡旋混合。
• 用超纯水将溶液最后定容至100 mL。
• 盖上烧瓶口并倒置几次以确保完全混合。
  注意：可以视需要调整制备的体积。

CaCl₂溶液（2 M氯化钙）— 在超纯水中用氯化钙二水合物（货号C3881）制备294 mg/mL溶液。

HCl溶液（1 mM盐酸）— 在100 mL A级容量瓶中，用超纯水将1 M盐酸溶液（货号H9892）稀释1,000倍。盖上烧瓶口并倒置几次以确保完全混合。将溶液置于冰上。

酶溶液（α-胰凝乳蛋白酶）— 在使用前，立即在冷的（2-8 ℃）HCl溶液中制备含有2-5 α-胰凝乳蛋白酶单位/mL的溶液。

操作流程

在3.00 mL反应混合物中，最终浓度为38 mM Tris，0.55 mM N-苯甲酰基-L-酪氨酸乙酯，30％（v/v）甲醇，53 mM氯化钙，0.03 mM盐酸和0.2-0.5单位的α-胰凝乳蛋白酶。

1.移取以下试剂到合适的石英比色皿中：

试剂	检测1（mL）	检测2（mL）	检测3（mL）	空白样(ml)
缓冲液	1.42	1.42	1.42	1.42
BTEE溶液	1.40	1.40	1.40	1.40
CaCl2溶液	0.08	0.08	0.08	0.08

2.倒置混合，并在已经对照空气归零的适当恒温的分光光度计中平衡至25 ℃。

3.移取以下试剂到比色皿中：

试剂	检测1（mL）	检测2（mL）	检测3（mL）	空白样(ml)
HCl溶液	–	–	–	0.10
酶溶液	0.05	0.07	0.10	–

4.立即通过倒置混合，并记录5分钟内的A₂₅₆增量。

5.确定空白和测试反应物的ΔA₂₅₆/分钟，使用一分钟时间间隔内的最大线性速率和至少4个数据点。

结果

计算

1.

式中：

TV = 比色皿中反应混合物的总体积（mL）
df = 稀释因子 0.964 = BTEE在256 nm时的毫摩尔消光系数 V_Test = 测定中使用的酶溶液的体积（mL）

2.

参考文献

1. Wirnt R, Bergmeyer HU. 1974. Methods of Enzymatic Analysis. New York: Academic Press.