REDExtract-N-Amp™ 植物PCR试剂盒实验方案

货号：XNAPS、XNAP和XNAPR

产品描述

Extract-N-Amp植物PCR试剂盒包含从植物叶片快速提取和扩增基因组DNA所需的所有试剂。简而言之，取一片叶片组织，采用标准打孔器打孔0.5-0.7 cm切片，然后在提取液中95 °C孵育10分钟，提取DNA。无需液氮冷冻植物组织、机械破碎、有机提取、柱纯化或DNA沉淀。将等体积的稀释液加入到加入抑制物质的提取液中，即可直接进行PCR。 

随后将一份稀释提取液与REDExtract-N-Amp PCR ReadyMix™及用户自备PCR引物混合，扩增靶标DNA。REDExtract-N-A mp PCR ReadyMix为含缓冲液、盐、Taq聚合酶的2X反应混合物。其专门针对反应试剂进行了优化。它还含有JumpStart™ Taq抗体（用于热启动PCR以增强特异性），以及REDTaq^® 染料（以将PCR产物直接加载到琼脂糖凝胶上）。 

所含试剂	货号	XNAPS 10次提取， 10次扩增	XNAP 100次提取， 100次扩增	XNARP 1000次提取， 1000次扩增
提取液	E7526	1.2 mL	12 mL	120 mL
稀释液	D5688	1.2 mL	12 mL	120 mL
REDExtract-N-Amp PCR ReadyMix 这种2X PCR反应混合物含有缓冲液、盐、dNTP、Taq聚合酶和JumpStart Taq抗体	R4775	0.15 mL	1.2 mL	12 mL
2 mL PCR 管	T5449 或者 T7813	非随附	2 X 50	非随附

需自备的试剂和设备

• 打孔器
• 镊子（中小款）
• 95 °C的加热块或恒温水浴
• PCR引物
• 水，PCR试剂，货号W1754

注意事项和免责声明

REDExtract-N-Amp植物PCR试剂盒仅供实验室使用，不可用于药物、家用或其他用途。有关危险和安全处理方法的信息，请参阅安全数据说明书。

储存方法

提取液、稀释液和REDExtract-N-Amp PCR ReadyMix可在2至8 °C下短期储存；
-20 °C下长期储存。请勿储存于“无霜”冰箱中。

操作流程

除非另有说明，否则所有步骤均在室温下进行。

A. DNA 提取

    1.在使用前及处理不同样品的间隙，采用70%乙醇冲洗打孔器和镊子。

    2.采用标准单孔打孔器打孔0.5 - 0.7 cm的圆孔样叶片组织，装入2 ml收集管。
        如果使用冷冻叶片组织，在打孔时将叶片置于冰上。

    3.将100 µL提取液加入收集管中。盖上管盖并短暂离心。确认培养皿
        已完全被提取液覆盖。

    4.在95 °C孵育10分钟。注意，通常情况下，此步处理后叶片组织
不会出现降解。

    5.加入100 µL稀释液，涡旋混合。

    6.将稀释后的叶片提取液2-8 °C储存。储存前不必取出叶片孔样。

B. PCR 扩增

REDExtract-N-Amp PCR ReadyMix含有JumpStart Taq抗体，可用于特定的热启动扩增。因此，PCR反应可以在室温下进行而不会过早产生Taq DNA聚合酶活性。

最终引物浓度通常约为0.4 µM。最佳引物浓度和循环参数取决于所使用的系统。

    1.将以下试剂加入薄壁PCR微量离心管或板中：

试剂	体积
PCR级水	X µL
REDExtract-N-Amp PCR ReadyMix	10 µL
正向引物	Y µL
反向引物	Y µL
叶片提取物	4 µL*
总体积	20 µL

*注意：REDExtract-N-Amp PCR ReadyMix配方用于补充提取液和稀释液组分。如果添加到PCR反应体积中的叶片提取液少于4 µL，用50:50的提取液：稀释液混合物使组织提取物的体积达到4 µL。

    2.轻轻混匀，短暂离心，在管底收集所有组分。

    3.如果热循环仪没有加热盖，需在每管混合物的上部加入20 µL矿物油防止蒸发。

    4.应针对个体引物、模板和热循环仪优化扩增参数。

常见的循环参数：

步骤	温度	时间	循环数
初始变性：	94 °C	3 min	1
变性	94 °C	0.5-1 min	30-35
退火	45 - 68 °C	0.5-1 min
延伸	72 °C	1-2 min (~1kb/min)
最后延伸	72 °C	10 min	1
保温	4 °C	不确定

    5.PCR结束后，将扩增的DNA加到琼脂糖凝胶上。
        不必加入单独的 上样缓冲液/示踪染料。

注意：如果需要，可对PCR产物进行纯化，用于下游应用，例如使用GenElute™ PCR纯化试剂盒（货号NA1020）进行测序。

故障排除指南

问题	原因	解决方案
检测到很少或没有PCR产物	植物提取物污染物抑制PCR反应。	用50:50的提取液和中和液混合物稀释组织提取物。为了检测抑制作用，需有DNA对照，并且/或者将已知量的模板（100-500个拷贝）与组织提取物一起进行PCR。
	PCR组分可能缺失或降解。	运行阳性对照，确保组份正常有效。还建议在组合各个反应时使用核查表。
	也许执行的循环数太少。	增加循环次数（每次增加5-10个循环）。
	退火温度可能太高。	将退火温度以2-4 °C增量递减。
	引物的设计可能不是最佳。	确认序列信息的准确性。如果引物长度小于22个核苷酸，则尝试加长引物至25-30个核苷酸。如果引物的GC含量低于45％，尝试重新设计GC含量为45-60％的引物。
	变性温度可能太高或太低。	将变性温度以1 °C增量递增或递减来进行优化。
	变性时间可能太长或太短。	将变性时间以10秒增量递增或递减来进行优化。
	延伸时间可能太短。	将延伸时间以1分钟增量递增，尤其是对于长模板。
	靶模板很困难。	大多数情况下，由于GC含量异常高和/或二级结构，靶标本就复杂。据报道，浓度为1.0-1.7 M的甜菜碱（货号B0300）有助于扩增GC含量高的模板。
多种产物	JumpStart Taq抗体无法正常工作	不要将DMSO或甲酰胺与Extract-N-Amp PCR反应混合物一起使用。它会干扰酶-抗体复合物。其他助溶剂、溶质（如盐）和pH或其他反应条件的极端情况可降低JumpStart Taq抗体对Taq聚合酶的亲和力，从而降低有效性。
	可能需要进行递减PCR。	“递减”PCR可显著提高各种应用中许多PCR反应的特异性。递减PCR包括在初始PCR循环期间使用高于引物TM的退火/延伸温度。然后在剩余的PCR循环中将退火/延伸温度降低至引物TM。可以在一个步骤中进行更改，也可以在几个周期内递减。
污染	试剂被污染	我们建议在每次PCR运行中使用不含DNA模板的试剂空白作为对照，以确定提取或PCR中使用的试剂是否被来自先前反应的模板污染。

致购买者：有限许可证

本产品的使用受到如下一项或多项美国专利及其对应的境外专利声明保护：5,789,224和5,618,711。基于仅将该数量的产品用于购买者自己内部研究的前述专利声明，购买该产品享有一项不受限、不可转移的诉讼豁免权。未通过明示、暗示或禁止反言形式授予购买者任何专利主张下的权利、执行任何专利方法的权利或开展任何形式的商业服务的权利，包括但不限于出于经济利益或其他商业考虑报告购买者的活动结果。本品仅供研究使用。如需用于Roche专利许可的诊断用途，需另外征得Roche许可。有关购买许可的更多信息，可联系Director of Licensing, Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404, USA获取。

参考文献

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5. Innis M. 1995. PCR Strategies. New York : Academic Press.

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