细胞系冻存

ECACC Laboratory Handbook 4th Edition

目标

图 1. 细胞系冻存

下述实验方案描述了细胞冷冻保存方法，包括采用-80°C冷冻电冰箱冷冻保存细胞系。ECACC 通常使用可编程速率可控冰柜。这是最可靠、最具可重现性的细胞冻存方法，但由于此类设备的成本超出了大多数研究实验室所能承受的范围，因此下文将详细描述其他一些方法。如果需要定期冷冻大量细胞培养物，则建议使用可编程速率可控冰柜。

材料

• 冷冻培养基（通常为90% FBS、10% DMSO (C6164)或甘油(C6039)）
• 70％ (v/v) 乙醇无菌水溶液(793213)
• PBS，不含Ca2+ / Mg2+(D8537)
• 0.05% 胰蛋白酶 / EDTA，溶于HBSS中，不含Ca2+/Mg2+(T3924)
• DMSO (D2650)

设备

• 个人防护装备（无菌手套、实验室工作服）
• 全脸保护面罩 / 护目镜
• 设置为37°C的水浴
• 适当密封水平的微生物安全柜
• 离心机
• 细胞计数板（Bright-Line™细胞计数板，货号：Z359629，改进型​​Neubauer-Camlab CCH.AC1）
• 预先贴好标签的安瓿瓶 / 冷冻管
• 细胞冷冻装置（例如Nalgene^® Mr. Frosty，货号：C1562）

要点

1. 最常用的冷冻保护剂是二甲基亚砜（DMSO），然而，它并不适用于所有细胞系，例如HL60，因为DMSO会诱导这种细胞分化。在这种情况下，应使用甘油等替代品（有关正确的冷冻保护剂详情，请参阅ECACC数据表）。
2. 上面推荐的ECACC冷冻培养基已被证明是适合大多数细胞类型的良好的通用培养基。另一种常用的冷冻培养基配方是：70％基础培养基、20％ FBS、10％ DMSO，但可能不适用于所有细胞类型。在定期使用之前，请确认是否适用于自身细胞。
3. 至关重要的是，培养物必须是健康的，并处于生长的对数阶段。用预先汇合的培养物（低于其最大细胞密度的培养物），在冷冻之前24小时更换培养基，即可实现这种条件。
4. 冷却速率可以改变，但一般原则是，每分钟降低1℃至3℃经证适合于大多数细胞培养物。
5. Mr. Frosty系统的替代方案是Taylor Wharton被动式冷冻柜，其中的安瓿瓶保存在杜瓦瓶颈的液氮蒸气中。该系统可让安瓿瓶逐渐降低，温度随之而降低。目前也有降温速率可控的冷冻柜，定期冷冻大量安瓿瓶时特别有用。
6. 最后，如果没有任何其他设备可用，可以将安瓿瓶放置在隔热良好的盒子内（例如壁厚至少1 cm的聚苯乙烯盒子），并置于-80℃下过夜。重要的是必须确保盒子在整个冷冻过程中保持直立。冷冻后的安瓿瓶应转移到液氮储存容器的气相中并记录位置。
7. 如果使用涉及-80°C冰柜的冷冻方法，则必须针对细胞系冷冻分区，避免无意取出样品。如果在冷冻的关键阶段出现这一类误操作，细胞活力会受影响。

图 2. DMSO瓶

图 3. Mr. Frosty容器

操作流程

1. 使用倒置显微镜观察培养物，以评估细胞密集程度，并确认不存在细菌和真菌污染物。收获在对数生长期细胞。对于贴壁细胞系，收获细胞汇合度应尽可能接近80-90％。
2. 用上述胰蛋白酶/EDTA使贴壁和半贴壁细胞悬浮，并将其重悬于至少相当于胰蛋白酶体积的一定体积的新鲜培养基中。悬浮细胞系可直接使用。
3. 取出一小部分细胞（100-200μL）并进行细胞计数。理想情况下，为实现良好的冷冻复苏率，细胞活率应超过90％。
4. 将剩余的培养物以150 x g离心5分钟。
5. 在冷冻培养基中以2-4x10⁶个细胞/mL的浓度重悬细胞。
6. 将1 ml 细胞等分移液到贴有标签的冷冻安瓿瓶中，标签须注明细胞系名称、传代数、细胞浓度和日期。
7. 将安瓿瓶放入被动式冷冻柜内，例如Nalgene Mr. Frosty。用异丙醇填充冷冻柜，并设置为-80℃过夜。
8. 冷冻后的安瓿瓶应转移到液氮储存容器的气相中并记录位置。

Bright-Line为Cambridge Instruments, Inc的商标。
Nalgene为Thermo Fisher Scientific或其附属公司的注册商标。

细胞冻存建议与技巧

通过冻存来保存细胞系有助于维护宝贵的实验室资源。如果操作不当，细胞系冻存可能会对细胞造成损伤、破坏实验，并对数据收集产生负面影响。本教程包括细胞冻存实验方案、有助于尽可能降低细胞冷冻对细胞损伤的建议与技巧，以及可用作冻存介质的不同溶液。