Technologia elektroforezy w żelu poliakryloamidowym Bis Tris
Technologia żelu Bis-Tris oferuje liczne zalety w porównaniu z tradycyjnymi żelami akrylamidowymi do zastosowań SDS-PAGE, w tym krótszy czas pracy i ostrzejszą rozdzielczość pasm.
Chemia żelu poliakrylamidowego
PAGE wykorzystuje nieciągły system buforowy, w którym jon buforu żelowego różni się od jonu buforu roboczego. Różnica w ruchliwości elektroforetycznej między tymi dwoma jonami tworzy ruchomy gradient napięcia, przez który przemieszczają się białka. Chemia żelu Tris-Glicyna jest najczęściej stosowanym systemem PAGE, który wykorzystuje żele składające się z Tris-HCl i buforu roboczego składającego się z zasady tris i glicyny. Żele Tris-Glicyna działają w środowisku silnie zasadowym, co może prowadzić do niepożądanych modyfikacji białek, takich jak deaminacja i alkilacja. W rezultacie pasma białkowe mogą być zniekształcone lub utracić rozdzielczość w żelach Tris-Glicyna.
Technologia żeli Bis-Tris
W przeciwieństwie do nich, żele Bis-Tris wykorzystują Bis-Tris i HCl w buforze żelowym oraz MOPS lub MES w buforze roboczym. Żele Bis-Tris działają przy neutralnym pH, minimalizując modyfikację białek i promując stabilność białek podczas pracy żelu. To neutralne pH prowadzi do ostrzejszej rozdzielczości i dokładności pasm białkowych. Żele Bis-Tris mają również dłuższy okres trwałości niż żele Tris-Glicyna, które z czasem zaczynają hydrolizować. Żele Bis-Tris można elastycznie łączyć z buforem roboczym na bazie MOPS lub MES; różnica w migracji między tymi dwoma jonami skutkuje różnymi zakresami separacji białek. MES powinien być stosowany, gdy interesujące białko jest małe (<50 kDa), podczas gdy MOPS powinien być stosowany do rozdzielania białek o średniej i dużej wielkości.
Rysunek 1.Cechy i zalety technologii Bis-Tris w porównaniu z tradycyjnymi żelami Tris-Glicyna
Rysunek 2.Porównanie żeli Tris-Glicyna (po lewej) i Bis-Tris (po prawej). Żele Tris-Glicyna i Bis-Tris zostały ręcznie odlane z 12% akrylamidem i pozostawione do polimeryzacji przez noc. Żele zostały obciążone identycznymi miareczkowaniami lizatu E. coli (pasy 3-6), niebarwionym wzorcem białka mPAGE® (pasy 2 i 7) oraz barwnym wzorcem białka mPAGE® (pas 1). Żele były badane w buforze Tris-Glicyna lub MOPS, barwione barwnikiem białkowym ReadyBlue™ przez jedną godzinę i odbarwiane wodą dejonizowaną przez jedną godzinę.
Porównanie buforów Tris-Glycine i Bis-Tris
Należy również wziąć pod uwagę rodzaj buforu do próbek używanego podczas przygotowywania białek. W przypadku żeli Tris-Glycine, bufor Laemmli jest zwykle używany do denaturacji i powlekania białek ujemnie naładowanymi jonami SDS. Próbki są następnie gotowane w temperaturze 100 °C, aby ułatwić denaturację. Podgrzanie buforu Laemmli do 100 °C powoduje, że pH staje się bardzo kwaśne. Wykazano, że połączenie ciepła i kwasowości powoduje rozszczepienie białka, preferencyjnie na wiązaniach peptydowych Asp-Pro1. To rozszczepienie prowadzi do widocznych produktów degradacji białek podczas elektroforezy. Z kolei żele Bis-Tris wykorzystują bufor do próbek LDS, który utrzymuje zasadowe pH podczas przygotowywania próbki i nie wymaga ogrzewania powyżej 70 °C w celu pełnej denaturacji białek. Preparat ten utrzymuje integralność białka poprzez minimalizację rozszczepienia wiązania peptydowego Asp-Pro.
Chemia żelu Tris-glicyna i Bis-Tris PAGE |
|---|
mPAGE® Bis-Tris Precast Gel for Protein Electrophoresis
System żeli mPAGE® Bis-Tris SDS-PAGE zapewnia wysoką wydajność, optymalny rozdział elektroforetyczny i lepszą rozdzielczość w szerokim zakresie mas cząsteczkowych. Prefabrykowane żele mPAGE® Bis-Tris mają uniwersalną konstrukcję, która pozwala na ładowanie większych objętości próbek. Format minikasety 10 x 8 cm sprawia, że żele mPAGE® Bis-Tris Precast Gels są kompatybilne z najpopularniejszymi urządzeniami do elektroforezy żelowej.
Żele mPAGE® Bis-Tris Precast Gels są przeznaczone do pracy wyłącznie z buforem roboczym MOPS lub MES. W zależności od tego, który bufor jest używany, można uzyskać bardzo różne wzory separacji. Bufor MOPS może być używany do precyzyjnego rozdzielania dużych i średnich białek, podczas gdy bufor MES zapewnia optymalne rozdzielanie mniejszych białek. Zapoznaj się z wykresami migracji (Rysunek 3), aby określić, który system buforu do pracy z żelem najlepiej nadaje się do zamierzonego zakresu separacji.
Rysunek 3.Wykresy migracji żeli prefabrykowanych mPAGE® Bis-Tris z buforem roboczym MOPS SDS i buforem roboczym MES SDS.
mPAGE® Turbo Mix Bis-Tris Gel Casting Kit
Zestaw mPAGE® TurboMix Bis-Tris Gel Casting Kit składa się z roztworu do rozpuszczania i roztworu do układania. Roztwory zostały zoptymalizowane w celu uproszczenia etapów przygotowania żelu i zminimalizowania odpadów odczynników. Roztwory mPAGE® TurboMix mogą być stosowane w tradycyjnych metodach odlewania lub w procedurze Quick Cast (Rysunek 4).
Procedura Quick Cast polimeryzuje w jednym kroku poprzez wylanie żelu układającego bezpośrednio po żelu rozpuszczającym.mPAGE® TurboMix Resolving Solution jest dostarczany w stężeniu 20% akryloamidu i przeznaczony do rozcieńczania wodą dejonizowaną, co pozwala na elastyczne odlewanie różnych zawartości procentowych żelu rozdzielającego. mPAGE® TurboMix Stacking Solution jest dostarczany w stężeniu 4% akrylamidu i wymaga jedynie dodania nadsiarczanu amonu (APS) i N,N,N',N'-tetrametyloetano-1,2-diaminy (TEMED).Aby uzyskać dodatkowe informacje na temat elektroforezy żelowej białek, odwiedź naszą stronę aplikacji elektroforezy żelowej dla wszystkich potrzeb związanych z odczynnikami i protokołami rozdzielania białek.
Rysunek 4.Metoda mPAGE® TurboMix Quick Cast oferuje szybki, 5-etapowy proces odlewania żeli poliakrylamidowych.
Odniesienie
Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.
Nie masz konta użytkownika?