Multipleksowanie próbek MULTI-seq do analizy i sekwencjonowania pojedynczych komórek

• System MULTI-seq i sekwencjonowanie następnej generacji (NGS)
• Protokół znakowania MULTI-seq
• Wydajność znakowania MULTI-seq i stabilność próbki.
• MULTI-seq i jednokomórkowa sekwencja RNA
• Przewodnik rozwiązywania problemów MULTI-seq
• Odczynniki MULTI-seq i produkty pokrewne

Single-cell RNA-seq (scRNA-Seq) jest potężnym, ale stosunkowo mało wydajnym narzędziem do analizy ekspresji genów na poziomie pojedynczej komórki. MULTI-seq został opracowany w celu multipleksowania typów próbek przy użyciu oligonukleotydów modyfikowanych lipidami (LMO) skompleksowanych z unikalnymi kodami kreskowymi próbek DNA, umożliwiając łączenie wielu próbek w tym samym procesie analizy pojedynczej komórki. Multipleksowanie próbek zmniejsza związane z tym koszty i zapewnia dodatkową moc identyfikacji artefaktów, takich jak dublety komórek w sekwencjonowaniu pojedynczych komórek i sekwencjonowaniu pojedynczych jąder (snRNA-Seq).

MULTI-seq LMO kotwiczą kody kreskowe próbek DNA na błonie komórkowej lub otoczce jądrowej dowolnej żywej komórki, zachowując żywotność komórki i endogenne wzorce ekspresji genów dla multipleksowania pojedynczych komórek. Komórki lub jądra znakowane MULTI-seq LMO są bezpośrednio wykorzystywane w przepływach pracy dla pojedynczych komórek, takich jak Chromium X (10x Genomics)¹. Kody kreskowe próbek MULTI-seq są oddzielane od endogennych bibliotek cDNA według rozmiaru podczas przygotowania i mogą być sekwencjonowane niezależnie lub jako część endogennej biblioteki cDNA. MULTI-seq nadaje się do zastosowań multipleksowania pierwotnych ludzkich komórek nabłonka gruczołu sutkowego, guzów poddanych kriokonserwacji, miejsc przerzutów wyizolowanych z mysiego modelu ksenoprzeszczepu pochodzącego od pacjenta, komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC), ZipSeq, siatkówki myszy i płuc myszy^2-5.

System MULTI-seq i sekwencjonowanie następnej generacji (NGS)

System MULTI-seq składa się ze zmodyfikowanych lipidami oligo kotwiczących (amid kwasu 3'-lignocerynowego), oligo kotwiczących (amid kwasu 5'- palmitynowego) i kodów kreskowych próbek DNA (Rysunek 1A-B). Oligo kotwiczące i specyficzny dla próbki kod kreskowy DNA są wstępnie mieszane, aby umożliwić hybrydyzację, a następnie dodawane do umytych komórek, gdzie hydrofobowa część kotwicząca lokalizuje kod kreskowy próbki DNA na błonach plazmatycznych. Późniejsza hybrydyzacja ko-kotwicy przedłuża retencję błonową kompleksu oligo przez co najmniej 2 godziny w badanych komórkach (Rysunek 1C-E i Rysunek 2A). Konstrukcja kodu kreskowego próbki DNA jest elastyczna i może być zoptymalizowana w zależności od platformy analizy pojedynczych komórek i zestawu biblioteki cDNA.

Opisujemy tutaj proces przechwytywania kodów kreskowych próbek DNA wraz z cząsteczkami mRNA z pojedynczych komórek. Kody kreskowe próbek DNA obejmują 3' poli-A (30 zasad), kod kreskowy próbki (8 zasad) i 5' uchwyt PCR, który jest niezbędny do przygotowania biblioteki i hybrydyzacji kotwicy (Rysunek 1B). Domena 3' poly-A naśladuje endogenne transkrypty, przez co jest wiązana przez kulki wychwytujące mRNA w kropelkach. Kody kreskowe próbek DNA wychwyconych przez kulki są połączone z kodami kreskowymi pojedynczych komórek i UMI w kropelkach, podobnie jak endogenne mRNA, i są przenoszone przez etapy odwrotnej transkrypcji i amplifikacji cDNA we wspólnym przepływie pracy dla pojedynczych komórek. Kody kreskowe próbek MULTI-seq (kod kreskowy próbki DNA + kod kreskowy pojedynczej komórki + UMI) i endogenne cDNA są oddzielane przez selekcję wielkości przed utworzeniem biblioteki NGS. Biblioteki kodów kreskowych próbek MULTI-seq są następnie konstruowane metodą PCR w celu dodania adaptorów sekwencji NGS, takich jak P5 i P7 (Rysunek 1F). 

Rysunek 1A. Schemat odczynnika MULTI-seq Lipid Modified Oligos. Osadzona w błonie para kotwica/ko-kotwica wyżarzona z kodem kreskowym próbki DNA.

Rysunek 1B. Sekwencje DNA kodów kreskowych Anchor, Co-Anchor i próbek DNA.

Rysunek 1C. Znakowanie MULTI-seq LMO kodem kreskowym próbki DNA. Krok 1: Wymieszaj kotwicę i kod kreskowy próbki DNA do hybrydyzacji.

Rysunek 1D. Znakowanie MULTI-seq LMO kodem kreskowym próbki DNA. Krok 2: Poddać mieszaninę kotwica/kod kreskowy działaniu komórek lub nukleaz. Inkubować przez 5 minut na lodzie.

Rysunek 1E. Znakowanie MULTI-seq LMO kodem kreskowym próbki DNA. Krok 3: Wprowadzić mieszaninę kotwicy i kodu kreskowego do komórek lub jąder komórkowych. Inkubować przez 5 minut na lodzie. Przemyć 1% BSA w celu wchłonięcia nadmiaru kotwic i ko-kotwic.

Rysunek 1F. Ukończona struktura biblioteki kodów kreskowych próbek MULTI-seq po dodaniu adaptera. Kod kreskowy próbki DNA jest przechwytywany za pomocą poli(dT), mRNA, a kod kreskowy pojedynczej komórki i sekwencje UMI są połączone z kodem kreskowym próbki DNA w przepływie pracy dla pojedynczej komórki. Frakcje kodu kreskowego próbki DNA są oddzielane od endogennego transkryptu cDNA przez selekcję kulek SPRI, podczas gdy adaptory NGS, takie jak P5 i P7, są dodawane przez PCR przed sekwencjonowaniem. Rozmiar bibliotecznego DNA zostanie wykryty w pozycji 180 ~ 200 bp.

Biblioteka kodów kreskowych próbek MULTI-seq może być sekwencjonowana jako część endogennej biblioteki cDNA lub niezależnie. Opublikowany protokół opiera się na zestawie odczynników Chromium Single Cell 3´ (V2 i V3), a uniwersalny starter I5 jest używany do budowy biblioteki kodów kreskowych próbek MULTI-seq ¹. Optymalizacja jest wymagana dla starterów PCR w zależności od sekwencji oligo kulek wychwytujących mRNA lub zestawów bibliotek, gdy stosowane są różne technologie jednokomórkowe lub zestawy bibliotek cDNA. Na przykład, gdy używany jest zestaw Nadia scRNA-seq (instrument Nadia, Dolomite Bio), do budowy biblioteki kodów kreskowych próbek MULTI-seq należy użyć hybrydowego oligo New-P5-SMART PCR zamiast uniwersalnego startera I5. Należy zauważyć, że MULTI-seq LMO zapewniają technologię lokalizacji kodu kreskowego próbki DNA do multipleksowania próbek, która jest elastyczna i może być dostosowana w zależności od aplikacji.

Tabela 1. Oligo kotwiczące i współkotwiczące MULTI-seq są dostępne razem jako numer katalogowy LMO001. Ponadto, 96 x 5′-końcowe i 96 x 3′-końcowe unikalne oligo z kodem kreskowym są dostępne do nabycia oddzielnie. Szczegóły dotyczące naszego niestandardowego produktu z kodem kreskowym, Next-Gen Sequencing Oligos (NGSO), można znaleźć na stronie SigmaAldrich.com/nextgenoligos, zgodnie z potrzebami poszczególnych aplikacji. Aby zminimalizować zanieczyszczenie krzyżowe starterów kodów kreskowych, należy zamówić jakość NGSO-Silver lub najlepiej NGSO-Gold. Prosimy o zapoznanie się z dostępnymi specyfikacjami, a następnie przesłanie zapytania o wycenę kodów kreskowych MULTI-seq na adres dnaoligos@milliporesigma.com. Sekwencje nie są dostarczane przed zakupem, ale zostaną uwzględnione w dokumentacji produktu w momencie dostawy.

Zastosowanie	Stężenie	Sekwencja
MULTI-seq Anchor oligo do znakowania komórek lub jąder.
MULTI-seq Anchor oligo do znakowania komórek lub jąder, katalog LMO001A	50 µM	Składnik zestawu MULTI-Seq (LMO001) - kotwica lignocerynowa z oligo DNA
MULTI-seq Co-anchor oligo do znakowania komórek lub jąder, katalog LMO001B	50 µM	Składnik zestawu MULTI-Seq (LMO001) - kotwica palmitynowa z oligo DNA
Kody kreskowe próbek z ogonem poli(A) do analizy mRNA	50 µM	5′-CCTTGGCACCCGAGAATTCCA- 8-base index-A30-3′
Kody kreskowe próbek do syntezy biblioteki 5' cDNA	50 µM	5'-CCTTGGCACCCGAGAATTCCA- 8-zasadowy indeks-CCCATATAAGAA-3'
Kod kreskowy próbki DNA znakowanej FAM #1<	50 µM	5´CCTTGGCACCCGAGAATTCCAGGAGAAG AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-FAM-3´
Startery TruSeq RPI	10 µM	5´-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNN GTGACTGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3´
Uniwersalny starter I5 dla użytkownika zestawu odczynników Chromium Single Cell 3	10 µM	5´-AATGATACGCGACCACCGAGATCTACACT CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3´
Dodatkowy starter MULTI-seq, używany w zestawie odczynników Chromium Single Cell 3´ (wer.2).	10 µM	5´-CTTGGCACCCGAGAATTCC-3´
New-P5-SMART PCR hybrid oligo. zestaw scRNA-Seq dla użytkownika Nadia	10 µM	5´-AATGATACGCGACCACCGAGATCTACACGCCTGT CCGCGGAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT*A*C-3´ * Gwiazdki oznaczają fosforotioanową modyfikację zasady

Protokół znakowania MULTI-seq

Przygotowanie oligos LMO i oligos z unikalnym kodem kreskowym próbki:

1. Połącz oligo kotwiczące i oligo unikalnego kodu kreskowego próbki do stężenia 2 µM każde w PBS (-) (bez Ca²⁺ i Mg²⁺). 

Odczynnik	1 próbka	2 próbki	3 próbki	4 próbki	5 próbek
Anchor Oligo (50 µM)	1 µL	1 µL x 2 (2 µL)	1 µL x 3 (3 µL)	1 µL x 4 (4 µL)	1 µL x 5 (5 µL)
Unikalny kod kreskowy oligo (50 µM)	1 µL	1 µL	1 µL	1 µL	1 µL
PBS (-)	23 µL	23 µL x 2 (46 µL)	23 µL x 3 (69 µL)	23 µL x 4 (92 µL)	23 µL x 5 (115 µL)
Objętość całkowita	25 µL	25 µL x 2	25 µL x 3	25 µL x 4	25 µL x 5

2. rozcieńczyć kotwicę do stężenia 2 µM w PBS (-). 

Odczynnik	1 próbka	2 próbki	3 próbki	4 próbki	5 próbek
Co-Anchor Oligo (50 µM)	1 µL	2 µL	3 µL	4 µL	5 µL
PBS (-)	24 µL	48 µL	72 µL	96 µL	120 µL
Objętość całkowita	25 µL	50 µL	75 µL	100 µL	125 µL

3. Przygotować 4 ml na próbkę 1% BSA w PBS (-) i umieścić na lodzie.

Przygotowanie komórek:

1. Przygotować zawiesinę pojedynczych komórek w PBS (-). Końcowe stężenie wynosi ~500 000 komórek w 180 µL. Jeśli PBS (-) nie ma zastosowania do próbek, użyj dowolnego buforu bez FBS lub surowicy w buforze.

Uwaga: Nie należy nadmiernie trypsynować przylegających komórek. Znakowanie LMO oligo może wpływać na wytrzymałość błony w zależności od typu komórek, a nadmiernie trypsynowane komórki mogą zostać uszkodzone podczas generowania kropli.

Znakowanie:

1. Dodaj 20 µL mieszaniny kotwicy i kodu kreskowego próbki DNA do 180 µL zawiesiny komórek i delikatnie wymieszaj za pomocą pipety.
2. Inkubować przez 5 minut na lodzie.
3. Dodać 20 µL roztworu Co-Anchor i delikatnie wymieszać pipetując.
4. Inkubować przez 5 minut na lodzie.
5. Dodaj 1 mL 1% BSA w PBS (-).
6. Wiruj komórki. Uwaga: Nie wiruj z dużą prędkością.
7. Płucz komórki 1% BSA w PBS co najmniej dwukrotnie przez wirowanie.
8. Zawiesić komórki w odpowiedniej ilości 1% BSA w PBS (-) do cytometrii przepływowej lub odpowiednim buforze do pracy z pojedynczymi komórkami.
9. W przypadku cytometrii przepływowej zmierzyć frakcję FAM dodatnią w celu oceny wydajności znakowania.

Przesłanie biblioteki NGS

Dodanie biblioteki MULTI-seq w stosunku molowym 1% do biblioteki cDNA zapewni wystarczające wyrównanie sekwencji kodu kreskowego biblioteki MULTI-seq.

Na przykład, połącz 0,5 µL biblioteki MULTI-seq o stężeniu 1 ng/µL z 49,5 µL biblioteki cDNA o stężeniu 2 ng/µL dla formatu 400M odczytów (MULTI-seq: cDNA=1:99). Sekwencja kodu kreskowego próbki DNA znajduje się po sekwencji poli(dT) od strony odczytu1 (Rysunek 1F). szczegółowy protokół został opublikowany jako dane uzupełniające.

MULTI-seq Wydajność znakowania i stabilność próbek

W celu ilościowego określenia wydajności i stabilności znakowania w próbkach, ludzkie fibroblasty napletka (HFF), komórki HEK293T i komórki NIH3T3 zostały krótko oznakowane kodem kreskowym próbki DNA #1 znakowanym FAM. Jak pokazano na Rysunku 2A, ponad 98% komórek zostało skutecznie wyznakowanych kodem kreskowym próbki DNA za pomocą oligos MULTI-seq LMO. Znakowanie jest stabilne przez co najmniej 2 godziny na lodzie, podczas gdy wydajność znakowania spada, gdy nie jest używana kotwica (Rysunek 2B).

Rysunek 2. Wydajność znakowania z kodem kreskowym próbki DNA znakowanej FAM#1. A) Ludzkie fibroblasty napletka (HFF), komórki HEK293 i komórki NIH3T3 znakowano kotwicą LMO i ko-kotwicą zawierającą znakowany FAM kod kreskowy próbki DNA#1. Wydajność znakowania mierzono za pomocą cytometrii przepływowej. Kanał GFP został użyty do wychwycenia populacji komórek FAM-dodatnich. B) Komórki znakowano zarówno kotwicą, jak i współkotwicą (zielony) lub tylko kotwicą (fioletowy) zawierającą kod kreskowy próbki DNA # 1 znakowany FAM. Komórki bez oligos LMO (tylko kod kreskowy próbki DNA # 1 znakowany FAM) zostały użyte jako kontrole negatywne (pomarańczowy). Po 1 godzinie w temperaturze pokojowej, komórki FAM dodatnie zostały wychwycone za pomocą cytometrii przepływowej. Wydajność znakowania była zmniejszona w warunkach pozbawionych kotwicy, co pokazuje, że oba oligo są niezbędne do skutecznego znakowania komórek.

MULTI-seq i Single-Cell RNA-seq

Wyniki eksperymentów scRNA-Seq poszczególnych użytkowników z MULTI-seq LMO podsumowano na Rysunkach 3 i 4. W obu eksperymentach odczynniki MULTI-seq działały wydajnie w zakresie multipleksowania i demultipleksowania próbek oraz rozróżniania dubletów.

Rysunek 3. dane próbek eksperymentalnych scRNA-Seq przy użyciu MULTI-seq LMO. PBMC wyizolowano od trzech makaków rezus i wyznakowano przeciwciałami fluorescencyjnymi (CD3/CD8/CD4). Równolegle z barwieniem przeciwciał, każda próbka została oznaczona unikalnym kodem kreskowym próbki MULTI-seq, zgodnie z instrukcjami producenta. Próbki zostały połączone, a komórki T CD8+ (CD3+/CD8+/CD4-) zostały posortowane do 30uL RPMI + 10% FBS przy użyciu FACS Aria. Komórki przetwarzano na urządzeniu 10x Genomics przy użyciu chemii 5´ GEX. Odczyty z biblioteki hashowania komórek były przetwarzane przy użyciu CITE-Seq-Count, a wywołania hashowania komórek były generowane przy użyciu algorytmu opartego na deMULTIplex. A) Etykietowanie MULTI-seq zapewnia silny sygnał na komórkę, z wyraźną separacją od tła. B) Mapa cieplna wykorzystująca dane z A pokazuje wyraźną separację próbek i zdolność do rozróżniania singletów, dubletów i komórek ujemnych. C) t-SNE przeprowadzono na znormalizowanej macierzy zliczeń, ilustrując wyraźne grupowanie według próbki.

Rysunek 4. MULTI-seq demultipleksowanie i QC eksperymentu scRNA-seq z użyciem 9 różnych kodów kreskowych. Surowe odczyty kodów kreskowych zostały przekształcone log-2 i wyśrodkowane, a następnie przetworzone przy użyciu pakietu klasyfikacyjnego MULTI-Seq (A). Obecność każdego kodu kreskowego sprawdzono wizualnie, wykonując t-SNE na znormalizowanej macierzy liczby kodów kreskowych. B1~B9 odpowiadają każdemu użytemu kodowi kreskowemu. Kolor wskazuje obfitość UMI kodu kreskowego z niskimi wartościami w kolorze czarnym i wysokimi wartościami w kolorze czerwonym. B) Wykres t-SNE wizualizujący klasyfikację kodów kreskowych komórek, z wyłączeniem negatywów. C) Mapa cieplna przedstawiająca klasyfikację kodu kreskowego komórki lub próbki na podstawie protokołu McGinnisa (ref. 1) jako adnotacje wiersza.

MULTI-seq Przewodnik rozwiązywania problemów

1. Problem: Generowanie kropelek nie powiodło się w komórkach znakowanych MULTI-seq.
   Zalecenie: Nie należy nadmiernie trypsynować przylegających komórek. Znakowanie LMO oligo może wpływać na wytrzymałość błony w zależności od typu komórek, a nadmiernie trypsynowane komórki mogą zostać uszkodzone podczas generowania kropli. Alternatywnie, należy użyć minimalnej ilości odczynnika MULTI-Seq. W tym protokole minimalna ilość ustawiona jest na użycie 20 µL 2 µM każdego oligo dla 500 000 komórek. Możliwe jest jednak zmniejszenie ilości oligo w zależności od próbek. Zalecamy ustawienie minimalnej ilości ze znakowanym FAM kodem kreskowym próbki DNA # 1 dla wrażliwych próbek.
2. Problem: Niska ilość biblioteki kodów kreskowych próbek DNA MULTI-seq:
   Zalecenie: Użyj więcej szablonu kodu kreskowego próbki DNA do PCR (do 7 ~ 14 ng kodu kreskowego DNA zamiast 3.5 ng).
3. Problem: Małe pasma są koamplifikowane w bibliotece kodów kreskowych próbek MULTI-seq (będzie to obserwowane, gdy więcej szablonu zostanie użyte do PCR):
   Zalecenie: Powtórz oczyszczanie 1,6X SPRI.

Referencje

1. McGinnis CS, Patterson DM, Winkler J, Conrad DN, Hein MY, Srivastava V, Hu JL, Murrow LM, Weissman JS, Werb Z, et al. 2019. MULTI-seq: sample multiplexing for single-cell RNA sequencing using lipid-tagged indices. Nat Methods. 16(7):619-626. https://doi.org/10.1038/s41592-019-0433-8

2. McGinnis CS, Siegel DA, Xie G, Hartoularos G, Stone M, Ye CJ, Gartner ZJ, Roan NR, Lee SA. 2021. No detectable alloreactive transcriptional responses under standard sample preparation conditions during donor-multiplexed single-cell RNA sequencing of peripheral blood mononuclear cells. BMC Biol. 19(1): https://doi.org/10.1186/s12915-020-00941-x

3. Hu KH, Eichorst JP, McGinnis CS, Patterson DM, Chow ED, Kersten K, Jameson SC, Gartner ZJ, Rao AA, Krummel MF. 2020. ZipSeq: barcoding for real-time mapping of single cell transcriptomes. Nat Methods. 17(8):833-843. https://doi.org/10.1038/s41592-020-0880-2

4. Weir K, Leavey P, Santiago C, Blackshaw S. Multiplexed Analysis of Retinal Gene Expression and Chromatin Accessibility using scRNA-Seq and scATAC-Seq. JoVE.(169): https://doi.org/10.3791/62239

5. Hurskainen M, Mi?íková I, Cook DP, Andersson N, Cyr-Depauw C, Lesage F, Helle E, Renesme L, Jankov RP, Heikinheimo M, et al. Single cell transcriptomic analysis of murine lung development on hyperoxia-induced damage. Nat Commun. 12(1): https://doi.org/10.1038/s41467-021-21865-2