Praca z PCR

• Uwagi ogólne
  • .Konfiguracja laboratorium w celu uniknięcia kontaminacji
  • Specjalny sprzęt
  • Składniki reakcji PCR
  • Thermal cycling profile for standard PCR
  • Właściwości enzymów PCR

• Czynniki do rozważenia w RT-PCR
  • .Wybór enzymów RT-PCR
  • Wybór starterów odwrotnej transkrypcji
  • Preparation of template RNA
  • .Primer design
  • RT-PCR procedures

• Zapobieganie skażeniom przenoszonym
  • Preventing carryover contamination with uracil-DNA glycosylase
    
  • .Zapobieganie kontaminacji w RT-PCR


• .Rozwiązywanie problemów
  • Brak produktu
  • Misincorporation or low fidelity
  • Nonspecific bands
  • Smeared bands
  • Low yield

Uwagi ogólne

Ustawienie laboratorium w celu uniknięcia zanieczyszczenia

Zdolność reakcji łańcuchowej polimerazy do amplifikacji pojedynczej cząsteczki oznacza, że śladowe ilości zanieczyszczeń DNA mogą służyć jako szablony, powodując amplifikację niewłaściwego szablonu (wyniki fałszywie dodatnie). Należy wziąć pod uwagę punkty wymienione poniżej, aby uniknąć zanieczyszczenia PCR z takich źródeł jak:

• Ławki laboratoryjne, sprzęt i urządzenia do pipetowania, które mogą być zanieczyszczone wcześniejszymi preparatami DNA, plazmidowym DNA lub oczyszczonymi fragmentami restrykcyjnymi.
  
• Zanieczyszczenia krzyżowe między próbkami.
  
• Produkty z poprzednich amplifikacji PCR.
  

Urządzenia laboratoryjne

• Należy używać co najmniej fizycznie oddzielonych miejsc pracy dla:
  • przygotowania wzorca przed PCR
  • ustawiania reakcji PCR
  • analizy po PCR
• Używaj cienkościennych probówek PCR, które są wolne od DNaz i RNaz.
• Używaj specjalnych, odpornych na aerozole końcówek do pipet i dedykowanego (używanego tylko do PCR) zestawu pipet, najlepiej pipet wyporowych.
• Jeśli to możliwe, przeprowadzaj reakcje PCR pod wyciągiem wyposażonym w światło UV. Przechowuj mikrowirówkę i jednorazowe rękawiczki, które są używane tylko do PCR pod wyciągiem.
  

Obsługa próbek

• Stosuj sterylne techniki i zawsze noś świeże rękawiczki podczas pracy w obszarze PCR. Często zmieniaj rękawiczki, zwłaszcza jeśli podejrzewasz, że zostały zanieczyszczone roztworami zawierającymi matrycę DNA.
• Zawsze używaj nowych i/lub wysterylizowanych naczyń szklanych, plastikowych i pipet do przygotowania odczynników PCR i matrycy DNA.
• Autoklawuj wszystkie odczynniki i roztwory, które można autoklawować bez wpływu na ich działanie. Oczywiście startery, dNTP i polimeraza Taq DNA nie powinny być autoklawowane. Posiadaj własny zestaw odczynników i roztworów PCR, które są używane tylko do PCR. Przechowuj te odczynniki w małych porcjach.
• Podczas pipetowania DNA unikaj tworzenia aerozoli, które mogą przenosić zanieczyszczenia.
• Zawsze dołączaj reakcje kontrolne, na przykład kontrolę negatywną ("bez DNA"), która zawiera wszystkie składniki reakcji z wyjątkiem matrycowego DNA, oraz kontrolę pozytywną, która została z powodzeniem zastosowana w poprzednich PCR.

Sprzęt specjalny

Rodzaj termocyklera

Termocykler musi co najmniej dokładnie i powtarzalnie utrzymywać trzy temperatury inkubacji PCR (patrz Thermal Cycling Profile for Standard PCR), zmieniać się z jednej temperatury do drugiej ("ramp") w określonym czasie, osiągać wybrane temperatury bez znaczącego przekroczenia lub zaniżenia oraz wielokrotnie i powtarzalnie przełączać się między temperaturami.

Uwaga: Warunki cyklu muszą być dostosowane w zależności od odpowiedniego termocyklera lub kombinacji primera/szablonu.

Rodzaj rurek reakcyjnych

Rurki reakcyjne wpływają na szybkość przenoszenia ciepła z termocyklera do mieszaniny reakcyjnej. Dlatego najlepiej używać cienkościennych probówek reakcyjnych, które są przeznaczone do PCR i które dokładnie pasują do studzienek konkretnej marki używanego termocyklera.

Składniki reakcji PCR

Szablon

Jakość szablonu wpływa na wynik reakcji PCR. Na przykład, duże ilości RNA w matrycy DNA mogą chelatować Mg²⁺ i zmniejszać wydajność PCR. Ponadto, nieczyste matryce mogą zawierać inhibitory polimerazy, które zmniejszają wydajność reakcji.

Uwaga: Aby uzyskać najczystszą matrycę, zawsze używaj produktu do oczyszczania specjalnie zaprojektowanego do oczyszczania DNA, takiego jak High Pure PCR Template Preparation Kit.

Ważna jest również integralność szablonu. Szablonowe DNA powinno mieć wysoką masę cząsteczkową. Aby sprawdzić rozmiar i jakość DNA, należy przeprowadzić próbkę na żelu agarozowym. Podczas testowania nowej matrycy zawsze należy uwzględnić kontrolę pozytywną ze starterami, które amplifikują produkt o znanej wielkości i zapewniają dobrą wydajność.

Ilość matrycy w reakcji silnie wpływa na wydajność PCR. Zalecana ilość matrycy dla standardowej reakcji PCR to:

• Maksymalnie 500 ng ludzkiego genomowego DNA
• 1 - 10 ng bakteryjnego DNA
• 0.1 - 1 ng plazmidowego DNA

Niskie ilości matrycy, na przykład 10 ng ludzkiego genomowego DNA, będą wymagały określonych modyfikacji reakcji, takich jak zmiany liczby cykli, przeprojektowanie starterów, użycie Hot Start itp.

Startery

W większości zastosowań PCR, to sekwencja i stężenie starterów decydują o ogólnym sukcesie testu. Dla wygody dostępnych jest kilka programów do projektowania starterów. Można je wykorzystać do zapewnienia, że sekwencje starterów mają następujące ogólne cechy:

• 18 - 24 zasad długości
• Brak wewnętrznej struktury drugorzędowej
• 40 - 60% G/C
• Zrównoważony rozkład domen bogatych w G/C i A/T.
• Nie są komplementarne do siebie na 3´ końcach (primer-dimery nie będą się tworzyć).
• Temperatura topnienia (Tm), która pozwala na temperatury wyżarzania od +55 do +65 °C (dla maksymalnej specyficzności należy stosować temperatury od +62 do +65 °C).

Uwaga: Optymalne temperatury wyżarzania są często wyższe niż Tm starterów (około +5 do +10 °C) i muszą być określone empirycznie. Dla obu starterów Tm powinna być podobna.

Zasady, które nie hybrydyzują z matrycą, mogą być dodawane na 5´ końcu startera (np. w celu wprowadzenia miejsc restrykcyjnych do produktu amplifikacji). Stężenia starterów między 0,1 a 0,6 µM są na ogół optymalne. Wyższe stężenia starterów mogą sprzyjać niewłaściwej amplifikacji i akumulacji niespecyficznego produktu. Niższe stężenia starterów mogą zostać wyczerpane przed zakończeniem reakcji, co skutkuje niższą wydajnością pożądanego produktu.

Uwaga: W przypadku niektórych systemów wyższe stężenie starterów (do 1 µM) może poprawić wyniki. Podczas testowania nowych starterów zawsze należy uwzględnić pozytywną reakcję kontrolną z matrycą, która została przetestowana pod kątem działania w PCR. Kontrola ta pokazuje, czy startery działają. Ludzki genomowy DNA firmy Roche jest dobrą matrycą kontrolną do oceny sekwencji ludzkich starterów.

Wybór polimerazy DNA

Wybór polimerazy DNA może znacząco wpłynąć na wynik PCR. Dla większości rutynowych PCR, polimeraza DNA Taq od dawna jest standardowym enzymem PCR. Polimeraza DNA Taq ma jednak swoje ograniczenia. Dla większości testów optymalna ilość termostabilnej polimerazy DNA (lub mieszanki polimeraz) będzie wynosić od 0,5 do 2,5 jednostki / 50 µL objętości reakcji. Zwiększone stężenie enzymu czasami prowadzi do zmniejszenia specyficzności.

MgCl₂ Stężenie

Mg²⁺ tworzy rozpuszczalne kompleksy z dNTPs w celu wytworzenia rzeczywistego substratu rozpoznawanego przez polimerazę. Stężenie wolnego Mg²⁺ zależy od stężenia związków wiążących ten jon, w tym dNTP, wolnego pirofosforanu (PPi) i EDTA. Aby uzyskać najlepsze wyniki, zawsze należy empirycznie określić optymalne stężenie Mg²⁺ . Optymalne stężenie Mg²⁺ może wahać się od około 1 do 5 mM. Najczęściej stosowane stężenie Mg²⁺ wynosi 1,5 mM (z dNTP w stężeniu 200 µM każdy). Mg²⁺ wpływa na aktywność enzymów i zwiększa Tm dwuniciowego DNA. Nadmiar Mg²⁺ w reakcji może zwiększyć niespecyficzne wiązanie starterów i zwiększyć niespecyficzne tło reakcji.

Stężenie trifosforanu deoksynukleotydu (dNTP)

Zawsze używaj zrównoważonych roztworów wszystkich czterech dNTP, aby zminimalizować poziom błędu polimerazy. Niezrównoważone mieszaniny dNTP zmniejszą wierność polimerazy Taq DNA.

Uwaga: Dla maksymalnej wygody, wstępnie zmieszana, zrównoważona mieszanina dNTP, taka jak PCR Nucleotide Mix może być dodana do mieszaniny reakcyjnej jako pojedynczy odczynnik. Ponadto, PCR grade dATP, dGTP, dCTP, dCTP, dCTP, dCTP.dCTP, dTTP oraz Zestaw trifosforanów deoksynukleozydów, klasa PCR.

Jeśli zwiększasz stężenie dNTP, musisz również zwiększyć stężenie Mg²⁺ . Zwiększenie stężenia dNTP zmniejsza ilość wolnego Mg²⁺, zakłócając w ten sposób aktywność polimerazy i zmniejszając wyżarzanie starterów. W celu zapobiegania zanieczyszczeniu przez przeniesienie, wyższe stężenie dUTP  jest zwykle stosowane zamiast dTTP (aby uzyskać szczegółowe informacje, zobacz Preventing carryover-contamination with uracil-DNA glycosylase). Końcowe stężenie dNTP powinno wynosić 50-500 µM (każdy dNTP). Najczęściej stosowanym stężeniem dNTP jest 200 µM.

pH

Ogólnie, pH buforu reakcyjnego dostarczonego z odpowiednią termostabilną polimerazą DNA (pH 8,3 - 9,0) daje optymalne wyniki. Jednak w przypadku niektórych systemów podniesienie pH może ustabilizować matrycę i poprawić wyniki.

Dodatki reakcyjne

W niektórych przypadkach dodanie następujących związków może zwiększyć wydajność lub specyficzność PCR:

• Betaina (0.5 - 2 M)
• Białko surowicy bydlęcej (BSA; 100 ng/50 µL)
• Detergenty
• Dimetylosulfotlenek (DMSO; 2 - 10%) (v/v)
• Żelatyna
• Glicerol (1 - 5%) (v/v)
• Pirofosfataza (0.001 - 0.1 jednostek/reakcję)
• Spermidyna
• Białko 32 genu T4
• Formamid

Thermal Cycling profile for Standard PCR

Initial Denaturation

Niezbędna jest całkowita denaturacja matrycowego DNA. Początkowe ogrzewanie mieszaniny PCR przez 2 minuty w temperaturze od +94 do +95 °C jest wystarczające do całkowitej denaturacji złożonego genomowego DNA, aby startery mogły annealować do matrycy podczas chłodzenia mieszaniny reakcyjnej. Jeśli matrycowy DNA jest tylko częściowo zdenaturowany, będzie miał tendencję do "odskakiwania" bardzo szybko, uniemożliwiając skuteczne wyżarzanie i wydłużanie starterów lub prowadząc do "samozasysania", co może prowadzić do fałszywie dodatnich wyników.

Krok denaturacji podczas cyklu

Denaturacja w temperaturze +94 do +95 °C przez 20-30 sekund jest zwykle wystarczająca, ale musi być dostosowana do używanego termocyklera i probówek. Na przykład, wymagane są dłuższe czasy denaturacji w probówkach 500 µL niż w probówkach 200 µL. Jeśli temperatura denaturacji jest zbyt niska, niecałkowicie stopione DNA "zatrzaskuje się", jak opisano wcześniej, nie dając w ten sposób dostępu do starterów. Użyj dłuższego czasu denaturacji lub wyższej temperatury denaturacji dla matrycowego DNA bogatego w GC.

Uwaga: Nigdy nie używaj dłuższego czasu denaturacji niż jest to absolutnie wymagane do całkowitej denaturacji matrycowego DNA. Niepotrzebnie długi czas denaturacji zmniejsza aktywność polimerazy DNA Taq.

Annealing primerów

Dla większości celów, temperatura annealingu musi być zoptymalizowana empirycznie. Wybór temperatury wyżarzania starterów jest prawdopodobnie najbardziej krytycznym czynnikiem w projektowaniu PCR o wysokiej specyficzności. Jeśli temperatura jest zbyt wysoka, nie dochodzi do wyżarzania, ale jeśli jest zbyt niska, niespecyficzne wyżarzanie dramatycznie wzrośnie. Primer-dimery utworzą się, jeśli startery mają jedną lub więcej komplementarnych zasad, dzięki czemu może wystąpić parowanie zasad między 3´ końcami dwóch starterów.

Przedłużanie starterów

Dla fragmentów do 3 kb, przedłużanie starterów jest zwykle przeprowadzane w temperaturze +72 °C. Polimeraza DNA Taq może dodać około 60 zasad na sekundę w temperaturze +72 °C. Przedłużanie trwające 45 sekund jest wystarczające dla fragmentów do 1 kb. W przypadku wydłużania fragmentów do 3 kb należy pozostawić około 45 sekund na kb. Czasy te mogą jednak wymagać dostosowania do określonych szablonów. Aby uzyskać lepszą wydajność, użyj funkcji wydłużania cyklu termocyklera. Na przykład, wykonaj pierwsze 10 cykli przy stałym czasie wydłużania (np., 45 sekund dla produktu 1 kb). Następnie, dla kolejnych 20 cykli, zwiększ czas wydłużania o 2-5 sekund na cykl (np. 50 sekund dla cyklu 11, 55 sekund dla cyklu 12 itd.). Wydłużenie cyklu daje enzymowi więcej czasu na wykonanie swojej pracy, ponieważ w miarę postępu PCR jest więcej matrycy do amplifikacji i mniej enzymu (z powodu denaturacji podczas długotrwałej wysokiej temperatury PCR) do wykonania wydłużenia.

Liczba cykli

W optymalnej reakcji, mniej niż 10 cząsteczek matrycy może być amplifikowanych w mniej niż 40 cyklach do produktu, który jest łatwo wykrywalny na żelu zabarwionym bromkiem etydyny. Większość reakcji PCR powinna zatem obejmować tylko od 25 do 35 cykli. Wraz ze wzrostem liczby cykli mogą gromadzić się niespecyficzne produkty (Rysunek 1).

Rysunek 1. Wpływ nadmiernej liczby cykli na nieczyste i czyste matryce. Produkt PCR (amplikon 245 bp z eksonu 6 genu receptora dopaminy 2) został ponownie amplifikowany w serii reakcji. W jednym zestawie eksperymentów matryca nie została oczyszczona przed jej użyciem. W drugim zestawie, matryca została oczyszczona przez elektroforezę w żelu agarozowym przed reamplifikacją. W obu zestawach matryca była amplifikowana przez 40, 60 lub 72 cykle. Alikwoty (8 µL) produktów analizowano na 3% żelu agarozowym.

MWM: Marker masy cząsteczkowej
40, 60, i 72: Liczba cykli amplifikacji.

Wyniki: W obu zestawach najniższa liczba cykli (40) dała najbardziej specyficzny produkt. W obu amplifikacjach 60 i 72 cykli pojawił się rozmaz, który zawierał multimeryczne "specyficzne" produkty PCR.
Zdjęcie dzięki uprzejmości U. Finckh i A. Rolfs, Wolny Uniwersytet w Berlinie, Niemcy.

Końcowe wydłużanie

Zwykle, po ostatnim cyklu, probówki reakcyjne są utrzymywane w temperaturze +72 °C przez 5 - 15 minut, aby promować zakończenie częściowych produktów wydłużania i wyżarzanie jednoniciowych produktów komplementarnych.

Właściwości enzymów PCR

Tabela 1 przedstawia profil zastosowań enzymów PCR dostarczonych przez firmę Roche.

Tabela 1 Profil zastosowania enzymów PCR dostarczonych przez Roche.

Długość	Długość sekwencji, które mogą być amplifikowane.
Specyficzność	Zakres niespecyficznej amplifikacji, w szczególności w przypadku amplifikacji trudnych szablonów. Im wyższa specyficzność, tym mniej produktów ubocznych jest generowanych.
Powtarzalność	Spójność wyników uzyskanych przy użyciu różnych partii enzymów.
Czułość	Zależność wydajności amplifikacji od ilości matrycy. Jeśli ilość matrycy jest ograniczona, należy użyć systemu enzymatycznego o wysokiej czułości.
Robustness	Podatność systemu enzymatycznego na czynniki zanieczyszczające lub inne czynniki, które zmniejszają wydajność amplifikacji, takie jak silne struktury drugorzędowe.
Dokładność	Współczynnik błędu systemu enzymatycznego określony przez względną liczbę błędnie inkorporowanych nukleotydów w porównaniu do polimerazy DNA Taq.
Carryover Prevention	Definiuje, czy system enzymatyczny może być używany z dUTP zamiast dTTP w celu zastosowania procedur zapobiegania przeniesieniu PCR przy użyciu glikozylazy uracylowej DNA (UNG).

Factors to Consider in RT-PCR

Wybór enzymów RT-PCR

Oczywiście, w RT-PCR głównym czynnikiem do rozważenia jest wybór odwrotnej transkryptazy używanej do syntezy cDNA. Ponieważ każdy z dostępnych enzymów ma inne właściwości enzymatyczne, jeden z nich może być bardziej odpowiedni do konkretnego eksperymentu niż inne. Poniżej omówiono najważniejsze właściwości enzymów.

Temperatura Optima

Wyższe temperatury inkubacji mogą pomóc wyeliminować problemy związane ze strukturą drugorzędową matrycy. Ponadto, wysoka temperatura poprawia specyficzność odwrotnej transkrypcji poprzez zmniejszenie fałszywego primingu. W związku z tym, termoaktywne odwrotne transkryptazy, które mogą być inkubowane w wysokich temperaturach (+50 do 70 °C) z większym prawdopodobieństwem wytworzą dokładne kopie mRNA, zwłaszcza jeśli matryca ma wysoką zawartość GC.

Uwaga: W tych wysokich temperaturach należy używać tylko specyficznych starterów; nie należy używać oligo(dT) lub losowych starterów heksamerowych.

Wymagania dotyczące jonów dwuwartościowych

Większość odwrotnych transkryptaz wymaga jonów dwuwartościowych do aktywności. Enzymy wykorzystujące Mg²⁺ prawdopodobnie będą produkować dokładniejsze kopie cDNA niż te, które wykorzystują Mn²⁺, ponieważ Mn²⁺ niekorzystnie wpływa na wierność syntezy DNA.

Specyficzność i wrażliwość

Odwrotne transkryptazy mają różną zdolność do kopiowania niewielkich ilości matrycy (wrażliwość). Różnią się również zdolnością do dokładnej transkrypcji struktur drugorzędowych RNA (specyficzność).

Profile enzymów

Tabela 2 przedstawia profile zastosowań enzymów RT-PCR i zestawów dostarczanych przez Roche.

Tabela 2. Profile zastosowań enzymów i zestawów RT-PCR dostarczanych przez firmę Roche.

Choice of Reverse Transcription Primers

Priming wpływa na wielkość i specyficzność produkowanego cDNA. Istnieją trzy rodzaje primerów, które mogą być używane do odwrotnej transkrypcji:

• Oligo(dT)12-18, który wiąże się z endogennym ogonem poli(A)+ na 3' końcu mRNA ssaków. Ten starter często wytwarza cDNA o pełnej długości.
• Przypadkowe heksanukleotydy, które wiążą się z mRNA w różnych komplementarnych miejscach i prowadzą do częściowej długości (krótkich) cDNA. Losowe heksanukleotydy mogą być idealne do przezwyciężenia trudności związanych z rozległą strukturą drugorzędową matrycy. Startery te mogą również wydajniej transkrybować regiony 5´ mRNA.
• Specyficzne startery oligonukleotydowe, które selektywnie primerują interesujący nas mRNA. Ten typ starterów jest z powodzeniem stosowany w testach diagnostycznych.

Przygotowanie matrycy RNA

Pomyślne przeprowadzenie RT-PCR wymaga wysokiej jakości, nienaruszonej matrycy RNA. Poniższe wskazówki pomogą w przygotowaniu matrycy:

• Aby zminimalizować aktywność RNaz, które są uwalniane podczas lizy komórek, należy dodać Protector RNase Inhibitor do mieszaniny lizującej lub użyć metod, które jednocześnie rozbijają komórki i inaktywują RNazy.
• Podejmij kroki w celu wyeliminowania wszystkich potencjalnych źródeł zanieczyszczenia RNazami z naczyń szklanych, plastikowych, odczynników itp.
• Używaj produktu specjalnie zaprojektowanego do oczyszczania kwasów nukleinowych w celu przygotowania początkowej matrycy RNA, takiego jak produkty do przygotowania RNA dostarczane przez Roche.
• Używaj oczyszczonego mRNA jako matrycy, a nie całkowitego RNA. Rozpoczęcie od poli(A)+ mRNA znacznie zwiększy prawdopodobieństwo udanej amplifikacji rzadkich mRNA, ponieważ udział mRNA w całkowitym preparacie RNA jest dość niski (zwykle 1-5% całkowitego RNA z komórki ssaka).
• Jeśli używasz mRNA jako matrycy, sprawdź integralność mRNA za pomocą elektroforezy żelowej przed użyciem go w RT-PCR. MRNA powinno pojawić się jako rozmaz między około 500 bp a 8 kb. Większość mRNA powinna wynosić od 1,5 kb do 2 kb.

Primer design

RT-PCR amplifikacja określonej sekwencji mRNA wymaga dwóch starterów PCR, które są specyficzne dla tej sekwencji mRNA. Projekt primera powinien również umożliwiać rozróżnienie pomiędzy amplifikowanym produktem cDNA a amplifikowanym produktem pochodzącym z zanieczyszczającego genomowego DNA. Istnieją dwa podejścia do projektowania wymaganych starterów (Rysunek 2).

Rysunek 2. Podejścia do projektowania starterów.

Panel 1: Stwórz startery, które annealują do sekwencji w eksonach po obu stronach intronu. Z tymi starterami, każdy produkt amplifikowany z genomowego DNA będzie znacznie większy niż produkt amplifikowany z mRNA bez intronów.
Panel 2: Stwórz startery, które obejmują granice eksonów/eksonów na mRNA. Takie startery nie powinny amplifikować genomowego DNA.

Procedury RT-PCR

RT-PCR można przeprowadzić jako procedurę dwuetapową lub jednoetapową. Każda z nich ma pewne zalety.

1. Procedury dwuetapowe

A. Procedura dwuetapowa w dwóch probówkach

W pierwszej probówce synteza pierwszej nici cDNA jest przeprowadzana w optymalnych warunkach, przy użyciu losowych heksamerów, starterów oligo(dT) (generujących pulę cDNA) lub starterów specyficznych dla sekwencji. Podwielokrotność reakcji RT jest następnie przenoszona do innej probówki (zawierającej termostabilną polimerazę DNA, bufor polimerazy DNA i startery PCR) do PCR.

Zalety tego podejścia: Metoda ta jest przydatna w eksperymentach, w których wiele transkryptów musi być analizowanych z tej samej reakcji RT lub do określonych zastosowań, takich jak odwrotna transkrypcja z wyświetlaniem różnicowym (DDRT) lub szybka amplifikacja końców cDNA (RACE). Ponadto, ponieważ reakcja RT jest przeprowadzana w optymalnych warunkach, podejście to wytwarza najdłuższe produkty RT-PCR (do 14 kb długości, jeśli stosowane są odpowiednie enzymy).

B. Procedura dwuetapowa w jednej probówce

W pierwszym etapie odwrotna transkryptaza wytwarza pierwszorzędowe cDNA w obecności jonów Mg²⁺ , wysokich stężeń dNTP i specyficznych lub niespecyficznych starterów [oligo(dT)] (objętość reakcji, 20 µL). Po reakcji RT do probówki dodaje się zoptymalizowany bufor PCR (bez jonów Mg²⁺ ), termostabilną polimerazę DNA i specyficzne startery, a następnie przeprowadza się PCR. Podejście to może być przydatne, gdy ilość matrycy jest ograniczona, ponieważ cała reakcja RT jest wykorzystywana w kolejnym PCR.

Dwuetapowa procedura ma następujące zalety:

• Optymalizuje warunki reakcji.
• Zapewnia elastyczność. Dwuetapowe procedury pozwalają na wykorzystanie produktu pojedynczej reakcji syntezy cDNA do analizy wielu transkryptów. Ta elastyczność jest cenna dla takich specjalistycznych zastosowań, jak szybka amplifikacja końców cDNA (RACE) i odwrotna transkrypcja z wyświetlaniem różnicowym (DDRT).
• Amplikuje długie sekwencje. Przy odpowiedniej kombinacji odwrotnej transkryptazy i termostabilnej polimerazy DNA, dwuetapowa RT-PCR może amplifikować sekwencje RNA o długości do 14 kb.

2. Jedna probówka, jednoetapowa procedura (sprzężona RT-PCR)

Zarówno synteza cDNA, jak i amplifikacja PCR są wykonywane przy użyciu tego samego buforu i starterów specyficznych dla miejsca, eliminując potrzebę otwierania probówki reakcyjnej między etapami RT i PCR. Oprócz wyższej czułości tego podejścia (jak w przypadku powyższej dwuetapowej reakcji w jednej probówce), podejście jednoetapowe minimalizuje ryzyko zanieczyszczenia, ponieważ cała reakcja jest wykonywana przy minimalnych krokach pipetowania i bez otwierania probówki. Ponadto podejście to pozwala na bezpośrednią analizę określonego transkryptu, ponieważ startery stosowane w obu etapach są specyficzne dla sekwencji. Wreszcie, termoaktywna odwrotna transkryptaza stosowana w tej procedurze pozwala na wysoką temperaturę reakcji RT (+50 do +72 °C), co zmniejsza fałszywe primingi i zwiększa specyficzność reakcji poprzez eliminację drugorzędowej struktury mRNA.

Jednoetapowa procedura ma następujące zalety:

• Minimalizuje wymagany czas.
• Zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia.
• Poprawia czułość i specyficzność syntezy cDNA. Dwie cechy reakcji jednoetapowej zapewniają zwiększoną wydajność i efektywność: (1) reakcja cDNA jest przeprowadzana w wysokiej temperaturze (w celu wyeliminowania problemów ze strukturą drugorzędową RNA) oraz (2) cała próbka cDNA jest używana jako matryca do PCR.

Prevention of Carryover Contamination

Preventing Carryover Contamination with Uracil-DNA Glycosylase

Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) może amplifikować pojedynczą cząsteczkę ponad miliard razy. W związku z tym nawet niewielkie ilości zanieczyszczeń mogą być amplifikowane i prowadzić do fałszywie dodatnich wyników. Takie zanieczyszczenia są często produktami wcześniejszych amplifikacji PCR (zanieczyszczenia przeniesione). Dlatego naukowcy opracowali metody unikania takich zanieczyszczeń.

Jedną z powszechnych strategii jest zastąpienie dUTP przez dTTP podczas amplifikacji PCR, w celu wytworzenia DNA zawierającego uracyl (U-DNA). Traktowanie kolejnych mieszanin reakcyjnych PCR glikozylazą Uracil-DNA (UNG) przed amplifikacją PCR, a następnie rozszczepienie apirymidynowych polinukleotydów w podwyższonej temperaturze (+95 °C) w warunkach alkalicznych (podczas początkowego etapu denaturacji) usunie zanieczyszczające U-DNA z próbki (rysunek 3). Ta metoda wymaga oczywiście, aby wszystkie reakcje PCR w laboratorium były przeprowadzane z dUTP zamiast dTTP.

Rysunek 3. Usuwanie zanieczyszczającego U-DNA za pomocą glikozylazy uracylo-DNA.

W przypadku stosowania produktów PCR zawierających dU w dalszych zastosowaniach należy zwrócić uwagę na następujące kwestie:

• Produkty PCR zawierające dU działają równie dobrze jak te zawierające dT, gdy są używane jako cele hybrydyzacji lub jako szablony do sekwencjonowania dideoksy.
• Produkty PCR zawierające dU mogą być klonowane bezpośrednio, jeśli są transformowane do niebakteryjnych gospodarzy.
• Podłoże zawierające dU jest łatwo trawione przez niektóre popularne enzymy restrykcyjne (np.Eco RI i Bam HI), podczas gdy inne wykazują zmniejszoną aktywność (np. Hpa I, Hind II, Hind III) na tych substratach.
• Nie zalecamy stosowania DNA zawierającego dU do wiązania białek lub badań interakcji DNA-białko.

Preventing Carryover Contamination in RT-PCR

Istnieją dwa sposoby zapobiegania zanieczyszczeniom podczas amplifikacji RNA:

• Użyj procedury RT-PCR z jedną probówką i jednym krokiem, aby zminimalizować liczbę czynności związanych z obsługą i pipetowaniem oraz liczbę razy, gdy probówka reakcyjna musi zostać otwarta. Minimalizuje to możliwość przeniesienia zanieczyszczeń w samej reakcji RT-PCR.
• Przeprowadź jednoetapową reakcję RT-PCR w obecności dUTP, tak aby wszystkie produkty zawierały dU i mogły zostać usunięte z kolejnej reakcji PCR za pomocą UNG (patrz Zapobieganie zanieczyszczeniu za pomocą glikozylazy Uracyl-DNA). Zapobiega to przenoszeniu zanieczyszczeń w kolejnych reakcjach PCR.

.Rozwiązywanie problemów

Oto kilka wskazówek dotyczących rozwiązywania problemów, które zebraliśmy w odniesieniu do PCR, w oparciu o pięć najczęściej obserwowanych objawów. Przed rozpoczęciem upewnij się, że zapoznałeś się z innymi wskazówkami dotyczącymi aplikacji.

Brak produktu

Oto kilka wskazówek dotyczących rozwiązywania problemów, które zebraliśmy, jeśli PCR nie daje produktu.

1. Nieoptymalne stężenie Mg²⁺

Sugestia: Miareczkuj stężenie magnezu za pomocą naszego Zestaw do optymalizacji PCR.

2. Ilość matrycy w reakcji nie jest optymalna

Niezbędna ilość matrycy różni się w zależności od reakcji. Jako wskazówkę należy użyć 100 - 750 ng ludzkiego DNA (10⁵ - 10⁶ kopii) na 100 µL reakcji. Ilość enzymu powinna być zoptymalizowana dla każdej matrycy.

Sugestia:

• Zmierz ilość matrycy w reakcji.
• Przeprowadź eksperyment optymalizacyjny zmieniając stężenie enzymu o 0,50 w sugerowanym zakresie (0.5 do 5,0 jednostek).

3. Inhibitor enzymu jest obecny w reakcji

Znane inhibitory PCR obejmują:

• 50 mM chlorek amonu
• EDTA (chelator metali)
• >0.8 µM hematyny
• PBS (fosforan wiąże wolny magnez)
• > 0,02 % sarkozylu
• 0.5 M mocznika
• >5% DMF
• >10% formamid
• Heparyna
• >20% dezoksycholan PEG
• >0.01% SDS (można odwrócić równym stosunkiem molowym NP40 i Tween 20)
• >10% DMSO
• >20% glicerol
• >0.4% N-oktyloglukozyd
• Residual phenol
• >0.06% dezoksycholanu sodu
• Pirofosforan

Sugestia: Zmniejsz lub usuń stężenie dowolnego inhibitora w mieszaninie reakcyjnej.

4. Temperatura annealingu primera jest zbyt wysoka lub zbyt niska

Temperatura annealingu primera wynosi zazwyczaj +50 do +60 °C (może być wyższa lub niższa w zależności od sekwencji primera i składników buforu).

Sugestia: Określ Tm/temperaturę wyżarzania na podstawie następujących równań:

Jeśli startery mają 20-35 zasad
Tp = 22 + 1.46 (Ln)
Ln = 2(# G lub C) + (# A lub T)
Tp = Efektywna temperatura wyżarzania ± 2 - 5

Jeśli startery mają 14 - 70 zasad
Tm = 81.5 + 16,6 (log10 [J+]) + 0,41 (% G + C) - (600/l) - 0,063 (% formamidu) + 3 do 12
[J+] = stężenie kationów jednowartościowych
l = długość oligo

5. Primery są zdegradowane lub nie są optymalne

Primery powinny mieć taką samą liczbę A i T w porównaniu do G i C, i powinny mieć co najmniej 14 zasad dla specyficzności.

Sugestie:

• Jeśli startery są krótkie i bogate w A-T, dodaj 0,9 - 2.0% (v/v) DMSO.
• Jeśli startery są bogate w G-C, dodaj 1 - 10% (v/v) formamidu.
• Podwójnie sprawdź sekwencję starterów, użyj programu do projektowania starterów, jeśli jest dostępny.
• Sprawdź podwielokrotność starterów na żelu, aby upewnić się, że nie uległy degradacji.

6. Niekompletna denaturacja matrycy

Niewystarczające ogrzewanie podczas etapu denaturacji jest częstą przyczyną niepowodzenia reakcji PCR. Bardzo ważne jest, aby reakcja osiągnęła temperaturę, w której następuje całkowite rozdzielenie nici. Temperatura około +94 °C przez 2 minuty powinna być odpowiednia w większości przypadków.

Jak tylko próbka osiągnie +94 °C, można ją schłodzić do temperatury annealingu. Rozległa denaturacja jest prawdopodobnie niepotrzebna, a ograniczona ekspozycja na podwyższone temperatury pomaga utrzymać maksymalną aktywność polimerazy podczas całej reakcji.

Bufory reakcyjne DNA o wyższym stężeniu Mg (4 - 5 mM) mogą wymagać wyższej temperatury denaturacji, aby umożliwić całkowite oddzielenie nici matrycy DNA. Zaleca się stosowanie dostarczonego buforu bez dodawania dodatkowego magnezu.

Sugestie:

• Podwyższyć początkową temperaturę denaturacji do +95 do +97 °C.
• Denaturować DNA minus enzym i bufor przez 4 - 6 minut.
• Zwiększ czas denaturacji cyklu o 15 - 30 sekund.
• Wypróbuj technikę Hot Start.
• Zamknięte koliste DNA powinno być rozszczepione przed PCR, niecięte koliste DNA renaturuje zbyt szybko.

7. Błąd maszynowy

Sugestie:

• Skalibruj blok grzejny i potwierdź rzeczywistą temperaturę bloku.
• Uruchom program diagnostyczny dla konkretnej maszyny - skontaktuj się z producentem maszyny w celu uzyskania szczegółowych informacji.

8. Błędne primery spowodowane strukturą drugorzędową matrycy, snapback lub nadmierną homologią na 3´ końcach primerów

Sugestie:

• Zwiększ początkową temperaturę denaturacji do +95 do +97 °C.
• Denaturuj DNA minus enzym i bufor przez 4 - 6 minut.
• Zwiększ czas denaturacji cyklu o 15 - 30 sekund.
• Wypróbuj technikę Hot Start.
• Dodaj białko T4 Gene 32 w ilości 3 - 5 µL / ml.
• Podczas projektowania starterów upewnij się, że nie ma więcej niż 2 zasady homologii na 3' końcu. Użyj programu do projektowania starterów, jeśli jest dostępny.
• Rozważyć dodanie kosolwentu do buforu reakcyjnego:
  • 3 - 15% DMSO
  • 1 - 10% formamid
  • 5 - 15% glikol polietylenowy
  • 10 - 15% glicerol

9. Stężenie NaCl powyżej 50 mM

Sugestie: Zmniejszyć stężenie NaCl

10. Stężenie KCl powyżej 50 mM

Sugestie: Zmniejszyć stężenie KCl

Błędna inkorporacja lub niska wierność

Oto kilka wskazówek dotyczących rozwiązywania problemów, które zebraliśmy w związku z błędną inkorporacją lub niską wiernością reakcji PCR.

1. Nieoptymalne stężenie Mg²⁺

Sugestia: Miareczkowanie stężenia magnezu przy użyciu naszego PCR Optimization Kit.

2. Stężenie nukleotydów jest zbyt wysokie lub niezrównoważone

Stężenie standardowe wynosi 20 - 200 µM każdego nukleotydu.

Sugestie:

• Sprawdź stężenie roztworów podstawowych wszystkich nukleotydów.
• Podwójnie sprawdź końcowe stężenia wszystkich nukleotydów.

3. pH buforu reakcyjnego jest zbyt wysokie

pH 8,3 jest optymalne.

Sugestie:

• PH buforu reakcyjnego można obniżyć do 5 - 6.
• Zmiany podstawienia zasad zmniejszyły się sześćdziesięciokrotnie, a zmiany przesunięcia ramki zmniejszyły się jedenastokrotnie przy spadku pH o 3 jednostki.

4. Nieprawidłowe primery spowodowane strukturą drugorzędową matrycy, snapback lub nadmierną homologią na 3´ końcach primerów

Sugestie:

• Podwyższenie początkowej temperatury denaturacji do +95 do +97 °C.
• Denaturuj DNA minus enzym i bufor przez 4 - 6 minut.
• Zwiększ czas denaturacji cyklu o 15 - 30 sekund.
• Wypróbuj technikę Hot Start.
• Dodaj białko T4 Gene 32 w ilości 3 - 5 µL / ml.
• Podczas projektowania starterów upewnij się, że nie ma więcej niż 2 zasady homologii na 3' końcu. Użyj programu do projektowania starterów, jeśli jest dostępny.
• Rozważyć dodanie kosolwentu do buforu reakcyjnego:
  • 3 - 15% DMSO
  • 1 - 10% formamid
  • 5 - 15% glikol polietylenowy
  • 10 - 15% glicerol

5. Uszkodzony szablon DNA

Sugestie:

• Zminimalizuj liczbę cykli, ponieważ wielokrotne ogrzewanie/chłodzenie przy wysokim pH może uszkodzić szablon (większość szablonów wymaga 25 - 35 cykli).
• Sprawdź integralność szablonu DNA.
• Skróć czas denaturacji do 15 - 30 sekund

Pasma niespecyficzne

Oto kilka wskazówek dotyczących rozwiązywania problemów, które zebraliśmy w odniesieniu do niespecyficznych pasm po reakcjach PCR.

1. Nieoptymalne stężenie Mg²⁺ 

Sugestia: Miareczkowanie stężenia magnezu przy użyciu naszego zestawu do optymalizacji PCR.

2. Stężenie nukleotydów jest zbyt wysokie lub niezrównoważone

Stężenie standardowe wynosi 20 - 200 µM każdego nukleotydu.

Sugestie:

• Sprawdź stężenie roztworów podstawowych wszystkich nukleotydów.
• Podwójne sprawdzenie końcowych stężeń wszystkich nukleotydów.

3. Zanieczyszczenie DNA/przeniesienie

Sugestie:

• Sprawdź przeniesienie wykonując PCR bez dodawania docelowego DNA.
• Unikaj przeniesienia (patrz poniżej).

Aby zapobiec przeniesieniu, należy stosować dobre praktyki laboratoryjne:

• Fizycznie izolować preparaty i produkty PCR
• Autoklawować roztwory, końcówki i probówki
• Odczynniki alikwotowe w celu zminimalizowania wielokrotnego pobierania próbek (nie więcej niż 20 reakcji na alikwot)
• Eliminuj aerozole za pomocą pipet z wypieraniem dodatnim
• Mieszaj odczynniki
• Dodaj DNA do reakcji jako ostatnie
• Dokonaj starannego wyboru kontroli pozytywnej i negatywnej
• Namocz pojemnik na żel i grzebienie w 1 M HCl, aby zdepurynować DNA
• Użyj nowych żyletek do wycięcia pasm
• Przykryj pudełko UV świeżą folią
• Zawsze używaj nakładki olejowej

Aby wyeliminować zanieczyszczenie/przeniesienie:

• Napromienianie UV: Wymieszać wszystkie składniki, z wyjątkiem matrycy DNA; naświetlać w przezroczystych probówkach polipropylenowych o pojemności 0,5 ml w bezpośrednim kontakcie ze szklanym transiluminatorem (żarówki UV 254 i 300 nm) przez 5 minut.
• Trawienie UG: Włącz nukleotydy dUTP do reakcji i wykonaj późniejsze trawienie glikozylazą uracylu DNA.

4. Temperatura wyżarzania primera jest zbyt niska

Temperatura wyżarzania primera wynosi zazwyczaj +50 do +60 °C (może być wyższa lub niższa w zależności od sekwencji primera i składników buforu).

Sugestia: Określ Tm/temperaturę wyżarzania na podstawie następujących równań:

Jeśli startery mają 20-35 zasad
Tp = 22 + 1.46 (Ln)
Ln = 2(# G lub C) + (# A lub T)
Tp = Efektywna temperatura wyżarzania ± 2 - 5

Jeśli startery mają 14 - 70 zasad
Tm = 81.5 + 16.6 (log10 [J+]) + 0.41 (% G + C) - (600/l) - 0.063 (% formamidu) + 3 do 12
[J+] = stężenie kationów jednowartościowych
l = długość oligo

5. Nieprawidłowe primery spowodowane strukturą drugorzędową matrycy, snapback lub nadmierną homologią na 3´ końcach primerów

Sugestie:

• Zwiększenie początkowej temperatury denaturacji do +95 do +97 °C.
• Denaturuj DNA minus enzym i bufor przez 4 - 6 minut.
• Zwiększ czas denaturacji cyklu o 15 - 30 sekund.
• Wypróbuj technikę Hot Start.
• Dodaj białko T4 Gene 32 w ilości 3 - 5 µL / ml.
• Podczas projektowania starterów upewnij się, że nie ma więcej niż 2 zasady homologii na 3' końcu. Użyj programu do projektowania starterów, jeśli jest dostępny.
• Rozważyć dodanie kosolwentu do buforu reakcyjnego:
  • 3 - 15% DMSO
  • 1 - 10% formamid
  • 5 - 15% glikol polietylenowy
  • 10 - 15% glicerolu

6. Primery są zdegradowane lub nie są optymalne

Primery powinny mieć taką samą liczbę A i T w porównaniu do G i C, a ich specyficzność powinna wynosić co najmniej 14 zasad.

Sugestie:

• Jeśli startery są krótkie i bogate w A-T, dodaj 0,9 - 2.0% (v/v) DMSO.
• Jeśli startery są bogate w G-C, dodaj 1 - 10% (v/v) formamidu.
• Podwójnie sprawdź sekwencję starterów, użyj programu do projektowania starterów, jeśli jest dostępny.
• Sprawdź podwielokrotność primerów na żelu, aby upewnić się, że nie uległy degradacji.

7. Stężenie starterów jest zbyt wysokie

Sugestia: Dostosuj stężenie starterów (0,1 - 1,0 µM każdego startera jest optymalne).

8. Liczba cykli jest zbyt wysoka

Większość szablonów wymaga 25 - 30 cykli.

Sugestia:Liczba cykli powinna być oparta na początkowym stężeniu matrycowego DNA.

Jeśli liczba cząsteczek docelowych w próbce wynosi...	Wtedy zalecamy następującą liczbę cykli....
3 x 105	25 - 30
1.5 x 104	30 - 35
1.0 x 103	35 - 40
50	40 - 45

9. Nieprawidłowy stosunek szablonu do enzymu

Niezbędna ilość szablonu różni się w zależności od reakcji. Jako wskazówkę należy użyć 100 - 750 ng ludzkiego DNA (10⁵ - 10⁶ kopii) na 100 µL reakcji. Ilość enzymu powinna być zoptymalizowana dla każdej matrycy.

Sugestie:

• Miareczkuj ilość matrycy w reakcji.
• Przeprowadź eksperyment optymalizacyjny zmieniając stężenie enzymu o 0,50 w sugerowanym zakresie (0,5 do 5,0 jednostek).

Smeared Bands

Oto kilka wskazówek dotyczących rozwiązywania problemów, które zebraliśmy w odniesieniu do rozmazanych pasm po reakcjach PCR.

1. Nieoptymalne stężenie Mg²⁺ 

Sugestia: Miareczkuj stężenie magnezu za pomocą naszego zestawu do optymalizacji PCR.

2. Stężenie nukleotydów jest zbyt wysokie lub niezrównoważone

Stężenie standardowe wynosi 20 - 200 µM każdego nukleotydu.

Sugestie:

• Sprawdź stężenie roztworów podstawowych wszystkich nukleotydów.
• Podwójne sprawdzenie końcowych stężeń wszystkich nukleotydów.

3. Zanieczyszczenie DNA/przeniesienie

Sugestie:

• Sprawdź przeniesienie wykonując PCR bez dodawania docelowego DNA.
• Unikaj przeniesienia (patrz poniżej).

Aby zapobiec przeniesieniu, należy stosować dobre praktyki laboratoryjne:

• Fizycznie izolować preparaty i produkty PCR
• Autoklawować roztwory, końcówki i probówki
• Odczynniki alikwotowe w celu zminimalizowania wielokrotnego pobierania próbek (nie więcej niż 20 reakcji na alikwot)
• Eliminuj aerozole za pomocą pipet z wypieraniem dodatnim
• Mieszaj odczynniki
• Dodaj DNA do reakcji jako ostatnie
• Dokonaj starannego wyboru kontroli pozytywnej i negatywnej
• Namocz pojemnik na żel i grzebienie w 1 M HCl, aby zdepurynować DNA
• Użyj nowych żyletek do wycięcia pasm
• Przykryj pudełko UV świeżą folią
• Zawsze używaj nakładki olejowej

Aby wyeliminować zanieczyszczenie/przeniesienie:

• Napromienianie UV: Wymieszać wszystkie składniki, z wyjątkiem matrycy DNA; naświetlać w przezroczystych probówkach polipropylenowych o pojemności 0,5 ml w bezpośrednim kontakcie ze szklanym transiluminatorem (żarówki UV 254 i 300 nm) przez 5 minut.
• Trawienie UG: Włącz nukleotydy dUTP do reakcji i wykonaj późniejsze trawienie glikozylazą uracylu DNA.

4. Temperatura wyżarzania primera jest zbyt niska

Temperatura wyżarzania primera wynosi zazwyczaj +50 do +60 °C (może być wyższa lub niższa w zależności od sekwencji primera i składników buforu).

Sugestia: Określ Tm/temperaturę wyżarzania na podstawie następujących równań:

Jeśli startery mają 20-35 zasad
Tp = 22 + 1.46 (Ln)
Ln = 2(# G lub C) + (# A lub T)
Tp = Efektywna temperatura wyżarzania ± 2 - 5

Jeśli startery mają 14 - 70 zasad
Tm = 81.5 + 16.6 (log10 [J+]) + 0.41 (% G + C) - (600/l) - 0.063 (% formamidu) + 3 do 12
[J+] = stężenie kationów jednowartościowych
l = długość oligo

5. Nieprawidłowe primery spowodowane strukturą drugorzędową matrycy, snapback lub nadmierną homologią na 3´ końcach primerów

Sugestie:

• Zwiększenie początkowej temperatury denaturacji do +95 do +97 °C.
• Denaturuj DNA minus enzym i bufor przez 4 - 6 minut.
• Zwiększ czas denaturacji cyklu o 15 - 30 sekund.
• Wypróbuj technikę Hot Start.
• Dodaj białko T4 Gene 32 w ilości 3 - 5 µL / ml.
• Podczas projektowania starterów upewnij się, że nie ma więcej niż 2 zasady homologii na 3' końcu. Użyj programu do projektowania starterów, jeśli jest dostępny.
• Rozważyć dodanie kosolwentu do buforu reakcyjnego:
  • 3 - 15% DMSO
  • 1 - 10% formamid
  • 5 - 15% glikol polietylenowy
  • 10 - 15% glicerol

6. Aktywność DNazy (wskazana przez smugi widoczne na żelu poniżej oczekiwanej wielkości pasma)

Sugestie:

• Przygotuj świeże roztwory podstawowe.
• Sprawdzić integralność matrycy DNA.

7. Zanieczyszczenie olejem próbki żelu

Temperatura annealingu starterów wynosi zazwyczaj +50 do +60 °C (może być wyższa lub niższa w zależności od sekwencji starterów i składników buforu).

Sugestia: Obróć probówkę reakcyjną i ostrożnie usuń warstwę oleju z powierzchni.

8. Nieprawidłowy stosunek szablonu do enzymu

Niezbędna ilość szablonu różni się w zależności od reakcji. Jako wskazówkę należy użyć 100 - 750 ng ludzkiego DNA (10⁵ - 10⁶ kopii) na 100 µL reakcji. Ilość enzymu powinna być zoptymalizowana dla każdej matrycy.

Sugestie:

• Miareczkuj ilość matrycy w reakcji.
• Przeprowadź eksperyment optymalizacyjny zmieniając stężenie enzymu o 0,50 w sugerowanym zakresie (0,5 do 5,0 jednostek).

Niska wydajność

Oto kilka wskazówek dotyczących rozwiązywania problemów, które zebraliśmy w odniesieniu do niskiej wydajności po reakcjach PCR.

1. Temperatura wyżarzania starterów jest zbyt wysoka

Temperatura wyżarzania starterów wynosi zazwyczaj +50 do +60 °C (może być wyższa lub niższa w zależności od sekwencji starterów i składników buforu).

Sugestia: Określ Tm/temperaturę wyżarzania na podstawie następujących równań:

Jeśli startery mają 20-35 zasad
Tp = 22 + 1.46 (Ln)
Ln = 2(# G lub C) + (# A lub T)
Tp = Efektywna temperatura wyżarzania ± 2 - 5

Jeśli startery mają 14 - 70 zasad
Tm = 81.5 + 16,6 (log10 [J+]) + 0,41 (% G + C) - (600/l) - 0,063 (% formamidu) + 3 do 12
[J+] = stężenie kationów jednowartościowych
l = długość oligo

2. Szablon nie jest czysty lub zdegradowany

Na przykład zanieczyszczenie proteazą może degradować polimerazę.

Sugestie:

• Spróbuj techniki Hot Start.
• Oczyść matrycę DNA w najwyższym możliwym stopniu, włączając w to trawienie proteinazą K.

3. Inhibitor enzymu jest obecny w reakcji

Znane inhibitory PCR obejmują:

• 50 mM chlorek amonu
• EDTA (chelator metali)
• >0.8 µM hematyny
• PBS (fosforan wiąże wolny magnez)
• > 0,02 % sarkozylu
• 0.5 M mocznika
• >5% DMF
• >10% formamid
• Heparyna
• >20% dezoksycholan PEG
• >0.01% SDS (można odwrócić równym stosunkiem molowym NP40 i Tween 20)
• >10% DMSO
• >20% glicerol
• >0.4% N-oktyloglukozyd
• Residual phenol
• >0.06% dezoksycholanu sodu
• Pirofosforan

Sugestia: Zmniejsz lub usuń stężenie dowolnego inhibitora w mieszaninie reakcyjnej.

4. niewystarczająca ilość matrycy w reakcji

Niezbędna ilość matrycy różni się w zależności od reakcji. Jako wskazówkę należy użyć 100 - 750 ng ludzkiego DNA (10⁵ - 10⁶ kopii) na 100 µL reakcji. Ilość enzymu powinna być zoptymalizowana dla każdej matrycy.

Sugestie:

• Zmierzyć ilość matrycy w reakcji.
• Przeprowadź eksperyment optymalizacyjny zmieniając stężenie enzymu o 0,50 w sugerowanym zakresie (0,5 do 5,0 jednostek).

5. Zbyt wysoka temperatura wydłużania

Optymalna temperatura i czas wydłużania zależy od wielkości fragmentu:

• +72 °C przez 20 sekund dla fragmentów <500 bp.
• +72 °C przez 40 sekund dla fragmentów 1.2 bp.

Sugestie: Dłuższe czasy, a nie wyższe temperatury powinny być stosowane, gdy obecne są dłuższe szablony lub podejrzewana jest struktura drugorzędowa.

6. Aktywność enzymu jest niska

W przypadku polimeraz Roche, 100% aktywność jest gwarantowana przez datę kontroli.

Sugestie:

• Sprawdź datę kontroli. Jeśli to konieczne, uzyskaj świeży enzym.
• Wypróbuj technikę Hot Start, aby pomóc zachować aktywność podczas cykli termicznych.

7. Liczba cykli jest zbyt wysoka

Większość szablonów wymaga 25 - 30 cykli.

Sugestia: Liczba cykli powinna być oparta na początkowym stężeniu matrycowego DNA.

Jeśli liczba cząsteczek docelowych w próbce wynosi...	Wtedy zalecamy następującą liczbę cykli....
3 x 105	25 - 30
1.5 x 104	30 - 35
1.0 x 103	35 - 40
50	40 - 45

8. Hydroliza nukleotydów

Zawsze przechowuj roztwory podstawowe nukleotydów w stężeniu co najmniej 10 mM, najlepiej 100 mM. Znacząca hydroliza występuje po przechowywaniu w stężeniu 1 mM przez 2 miesiące.

Rozpuścić NTP lub dNTP w wodzie w oczekiwanym stężeniu 10 mM. Używając 0,05 M zasady Tris i papierka pH, dostosuj pH do 7,0. Odpowiednio rozcieńczyć porcję zneutralizowanego NTP lub dNTP i odczytać gęstość optyczną przy długościach fal podanych w poniższej tabeli. Oblicz rzeczywiste stężenie, korzystając z wartości współczynników ekstynkcji. Zamrozić w małych porcjach w temperaturze -20 °C.

Zasada	Długość fali	Współczynniki ekstynkcji dla zasad e (M-1 cm-1)
A	259	1.54 x 104
T	260	7.4 x 103
G	253	1.37 x 104
C	271	9.1 x 103
U	262	1.0 x 104

Sole litu i sodu mają równoważną stabilność i działają równie dobrze w zastosowaniach PCR, sekwencjonowania i etykietowania. Sole litu są lepiej rozpuszczalne w etanolu niż sole sodu. Zatem usuwanie soli litu przez wytrącanie etanolem jest bardziej wydajne niż usuwanie soli sodu. Stosowanie preparatów nukleotydów soli litu zmniejsza artefakty wywołane solą i zwiększa czytelność żeli sekwencjonowania.

9. Stężenie nukleotydów jest zbyt wysokie lub niezrównoważone

Stężenie standardowe wynosi 20 - 200 µM każdego nukleotydu.

Sugestie:

• Sprawdź stężenie roztworów podstawowych wszystkich nukleotydów.
• Podwójnie sprawdź końcowe stężenia wszystkich nukleotydów.

10. Stężenie primera jest zbyt niskie

Sugestia: Dostosuj stężenie primera (0,1 - 1,0 µM każdego primera jest optymalne).

11. Błąd maszynowy

Sugestie:

• Skalibruj blok grzewczy i potwierdź rzeczywistą temperaturę bloku.
• Uruchom program diagnostyczny dla konkretnej maszyny - skontaktuj się z producentem maszyny w celu uzyskania szczegółowych informacji.

12. Efekt plateau

Możliwe przyczyny efektu plateau/rozwiązania:

• Użycie dNTP - stężenie dNTP powinno wynosić 20 - 200 µM każdy.
• Hamowanie pirofosforanu produktu końcowego - zmniejsz liczbę cykli do 20 - 35, aby zmniejszyć tworzenie pirofosforanu.
• Niekompletna denaturacja produktu przy wysokim stężeniu - stosować cykle stopniowe, zwiększając czas denaturacji w późniejszych cyklach.
• Nadmiar substratu w stosunku substrat/enzym - stosować cykle stopniowe, zwiększając czas wydłużania w późniejszych cyklach lub stężenie enzymu.

13. Odparowanie

Odparowanie może prowadzić do wyższych stężeń składników, które mogą hamować aktywność enzymu. Zmiana objętości prowadzi również do zmian profilu termicznego wewnątrz probówek reakcyjnych.

Sugestia: Stosować 100 µL oleju mineralnego na nakładkę/reakcję.