Oznaczanie kwasu askorbinowego i kwasu dehydroaskorbinowego w różnych produktach spożywczych i suplementach - proste podejście oparte na HPTLC

Markus Burholt, Scientist Instrumental Analytics R&D, Monika Bäumle, Global Product Manager Thin-Layer Chromatography

Merck

Article from Analytix Reporter - Issue 14

Wprowadzenie

Witamina C lub kwas askorbinowy to witamina występująca naturalnie w wielu owocach i niektórych warzywach lub dodawana do niektórych przetworzonych produktów spożywczych lub suplementów diety. Jest rozpuszczalna w wodzie i ma właściwości przeciwutleniające poprzez degradację do kwasu dehydroaskorbinowego. Organizm ludzki nie może wytwarzać kwasu askorbinowego i musi on być spożywany z pożywieniem lub suplementami. Pełni ona istotne funkcje w organizmie człowieka i utrzymuje wiele procesów życiowych. W przypadku niedoboru witaminy C (szkorbut) mogą wystąpić objawy, takie jak zmęczenie, znużenie i stany zapalne. Zalecana dzienna dawka kwasu askorbinowego wynosi około 100 mg dziennie i można ją łatwo osiągnąć stosując zdrową, zbilansowaną dietę. Zazwyczaj kwas askorbinowy jest oznaczany ilościowo za pomocą miareczkowania jodometrycznego zgodnie z metodą USP.¹ Wymagana jest dodatkowa identyfikacja substancji i przeprowadzana np. za pomocą analizy w podczerwieni.¹

W poniższej aplikacji pokazujemy łatwe i szybkie podejście przesiewowe do jednoczesnej analizy ilościowej kwasu askorbinowego i kwasu dehydroaskorbinowego za pomocą wysokosprawnej chromatografii cienkowarstwowej (HPTLC). Chromatografia cienkowarstwowa (TLC) i HPTLC są wygodnymi, szybkimi i wydajnymi technikami separacji, które umożliwiają rozwój metod analitycznych bez potrzeby intensywnego przygotowywania próbek lub wysokich inwestycji.² W połączeniu z MS możliwa jest późniejsza identyfikacja substancji. Niski koszt i krótki czas analizy na próbkę są zapewnione przez równoległą analizę kwasu askorbinowego w produktach spożywczych na jednej płytce. Ponadto, wysoka tolerancja matrycy TLC oferuje dodatkowe możliwości dla istniejących rutynowych metod. Wysoka lepkość i wysoka zawartość cukru w wielu produktach zawierających kwas askorbinowy (np. soki owocowe) sprawia, że są to bardzo złożone i bogate w matrycę próbki do analizy.

Warunki eksperymentalne

Pięć różnych dostępnych na rynku produktów zawierających kwas askorbinowy, takich jak koncentrat soku, gumy owocowe, tabletka musująca z witaminą C, tabletka musująca z wieloma witaminami oraz tabletka z ekstraktem z żurawiny, analizowano w warunkach przedstawionych w Tabeli 1.

.

Tabela 1. Warunki doświadczalne oznaczania kwasu askorbinowego i kwasu dehydroaskorbinowego

Warunki HPTLC
Płytka:	HPTLC Silica gel 60 F254s, 20x10cm (1.15696)
Objętość aplikacji:	0,3 - 5.0 µL (jak wskazano w tabelach 2 i 4a), aplikacja pasmowa, pasma 6 mm
Detekcja:	366 nm
Komora:	20x10 Komora bez bibuły filtracyjnej
Faza ruchoma:	aceton/toluen/kwas mrówkowy 60:30:10 (v/v/v)
Odległość migracji:	6 cm
hRf:	kwas askorbinowy= 45; kwas dehydroaskorbinowy= 58
Suszenie:	50 °C
Próbki
Mieszanina rozpuszczalników:	Etanol/woda 1:1 (v/v)
Standardowe przygotowanie:	Kwas askorbinowy: około 10 mg kwasu askorbinowego odważono w 10.00 mL kolbie pomiarowej i napełniono roztworem mieszaniny rozpuszczalników   Kwas dehydroaskorbinowy: około 10 mg kwasu dehydroaskorbinowego odważono w 10.00 mL kolby miarowej i napełniono roztworem mieszaniny rozpuszczalników
Próbki:	Koncentrat soku: 1,0 ml soku przeniesiono do kolby miarowej i napełniono mieszaniną rozpuszczalników   Guma owocowa: gumy owocowe przechowywano w zamrażarce przez kilka godzin. Następnie zmielono je mikserem (blenderem) przez kilka sekund. Około 2,0 g kawałków odważono do kolby, napełniono 10,0 ml mieszaniny rozpuszczalników i odwirowano. Supernatant wykorzystano do analizy   Tabletka musująca z witaminą C: tabletkę sproszkowano za pomocą moździerza. Około 250 mg odważono do kolby i napełniono 10,0 ml mieszaniny rozpuszczalników   Multiwitaminowa tabletka musująca: tabletkę sproszkowano w moździerzu. Około 250 mg odważono w kolbie i napełniono 10,0 ml mieszaniny rozpuszczalników   Tabletka z ekstraktem z żurawiny: tabletkę sproszkowano w moździerzu. Około 100 mg odważono do kolby i napełniono 10.0 ml mieszaniny rozpuszczalników
HTPLC-MS
Pomiar MS:	Rozpuszczalnik ekstrakcyjny: Acetonitryl/woda 95:5 (v/v) + 0,1% kwas mrówkowy   Próbki ekstrahowano za pomocą Plate Express i mierzono za pomocą jednokwadrupolowego spektrometru mas expression CMS firmy Advion   Tryb MS: ESI Mode-, Widmo 1, kwas askorbinowy, zmierzona masa cząsteczki 175,0 (M-H). Widmo 2, kwas dehydroaskorbinowy, zmierzona masa cząsteczki 173,1 (M-H)

Ze względu na swoją zdolność utleniania, kwas askorbinowy ulega szybkiemu rozkładowi i powstaje kwas dehydroaskorbinowy. Wiarygodne oznaczenie ilościowe kwasu askorbinowego może być trudne i wymaga delikatnej, ale szybkiej analizy próbek. W praktyce kwas askorbinowy może być oznaczany ilościowo wraz z niewielką ilością jego produktu dehydratacji - kwasu dehydroaskorbinowego. (Rysunek 1). Aby zasymulować ten efekt, w tym eksperymencie wzorce kwasu askorbinowego zostały przesycone kwasem dihydroksyaskorbinowym.

Rysunek 1. Struktura chemiczna kwasu askorbinowego i kwasu dehydroaskorbinowego.

Krzywe kalibracji kwasu askorbinowego i kwasu dehydroaskorbinowego zostały ustalone w oparciu o 3 różne zastosowane objętości standardowe (Tabela 2). Po rozdzieleniu przeprowadzono szybkie i proste potwierdzenie substancji za pomocą MS.³

Tabela 2. Zastosowane rozwiązania kalibracyjne

Punkty	Objętość aplikacji (µL)	Opis
1, 9, 17	1.5	Roztwór wzorcowy kwasu askorbinowego, naniesiony najpierw na ścieżki wzorcowe
2, 10, 18	3.0
3, 11, 19	5.0
1, 9, 17	0.3	Wzorcowy roztwór kwasu dehydroksyaskorbinowego, nałożony na plamy kwasu askorbinowego.
2, 10, 18	1.0
3, 11, 19	2.0

Próbki i wzorce zostały naniesione pasmowo (6,0 mm). Najpierw zastosowano serię stężeń wzorców kwasu askorbinowego, a następnie naniesiono na nie wzorce kwasu dehydroaskorbinowego. Ze względu na spodziewane niższe stężenie kwasu dehydroaskorbinowego, objętość próbki była mniejsza niż w przypadku kwasu askorbinowego.

Płytkę rozwinięto za pomocą fazy ruchomej, a następnie wysuszono w temperaturze 50 °C do całkowitego wyschnięcia. W celu oznaczenia ilościowego płytkę ogrzewano w temperaturze 110 °C przez 10 minut. Badanie płytki przeprowadzono przy długości fali 366 nm.

Wyniki i dyskusja

Przy oświetleniu 366 nm kwas askorbinowy pojawia się przy hR_f 45, a kwas dehydroaskorbinowy przy hR_f 58 (Rys. 2). Pomiar MS plamek (przed ogrzewaniem) został przeprowadzony w celu potwierdzenia identyfikacji substancji.³

Rysunek 2. Wizualizacja płytki pod UV 366 nm. Kwas askorbinowy pojawia się przy hR_f 45, a kwas dehydroaskorbinowy przy hR_f 58.

Profile roztworu kalibracyjnego (Tabela 2) przy długości fali 366 nm zostały wykorzystane do ustalenia krzywych kalibracyjnych i oznaczenia ilościowego (Tabela 3, Rysunek 3 &4) w odniesieniu do ilości naniesionej na płytki.

Tabela 3. Wyniki 3 roztworów kalibracyjnych dla kwasu askorbinowego i kwasu dehydroaskorbinowego

Związek	Ilość (µg)	Średnia powierzchnia (AU)
Kwas askorbinowy	1.54	0.00647
	3.08	0.01144
	5.15	0.01867
Kwas dehydroaskorbinowy	0.30	0.00461
	1.00	0.01286
	1.99	0.02822

Rysunek 3. Wykres kalibracyjny z odpowiednią funkcją kalibracji kwasu askorbinowego.

Rysunek 4. Wykres kalibracyjny z odpowiednią funkcją kalibracji kwasu dehydroksyaskorbinowego.

Dane kalibracyjne zostały wykorzystane do ilościowego określenia zawartości witaminy C w pięciu zastosowanych próbkach. We wszystkich 5 próbkach można było oznaczyć kwas askorbinowy, a także kwas dehydroaskorbinowy. Wyniki przedstawiono w Tabeli 4 a & b.

 

.

Tabela 4a. Wyniki ilościowe zmierzonych próbek

Próbka	Pozycja aplikacji	Konc. Próbka (mg/ml)	Objętość aplikacji (µL)	Substancja	Średnia powierzchnia (AU)	Średnia ilość (µg)	RSD %	Zawartość witamin w roztworze próbki (mg/mL)
Koncentrat soku	4, 12, 20	100.0	4.0	Kwas askorbinowy	0.01046	2.790	2.01	0.70
				Kwas dehydroaskorbinowy	0.01113	0.862	3.38	0.22
Guma owocowa	5, 13, 21	200.0	3.0	Kwas askorbinowy	0.01076	2.881	2.08	0.96
				Kwas dehydroaskorbinowy	0.00749	0.562	3.74	0.19
Tabletka musująca z witaminą C	6, 14, 22	25.0	2,5	Kwas askorbinowy	0.01026	2.731	3.63	1.09
				Kwas dehydroaskorbinowy	0.01014	0.783	4.78	0.31
Multiwitaminowa tabletka musująca	7, 15, 23	24.9	3,5	Kwas askorbinowy	0.01254	3.412	2.25	0.97
				Kwas dehydroaskorbinowy	0.01604	1.225	1.87	0.35
Tabletka z żurawiną	8, 16, 24	9.9	5.0	Kwas askorbinowy	0.01368	3.744	0.90	0.75
				Kwas dehydroaskorbinowy	0.00676	0.498	0.95	0.10

Tabela 4b. Obliczone współczynniki odzysku (oczekiwane wartości to dane podane na opakowaniach testowanych produktów)

Próbka	Zaw. Próbka (mg/ml)	Substancja	Zawartość witamin w roztworze próbki (mmol/L)	Zawartość łączna (mmol/L)	Oczekiwana zawartość (mmol/L)	Stopień odzysku %
Koncentrat soku	100.0	Kwas askorbinowy Kwas dehydroaskorbinowy	3.960 1.238	5.197	3.407	153
Guma owocowa	200.0	Kwas askorbinowy Kwas dehydroaskorbinowy	5.452 1.075	6.527	17.016	38
Witamina C tabletka musująca	25.0	Kwas askorbinowy Kwas dehydroaskorbinowy	6.202 1.799	8.001	5.683	141
Multi Vitamin tabletka musująca	24.9	Kwas askorbinowy Kwas dehydroaskorbinowy	5.535 2.010	7.545	4.480	168
Tabletka z żurawiną	9.9	Kwas askorbinowy Kwas dehydroaskorbinowy	4.252 0,571	4,823	4.480	108

Wnioski

Opracowana procedura aplikacji zapewnia prostą metodę opartą na analizie kwasu dehydroaskorbinowego i askorbinowego w różnego rodzaju próbkach i matrycach za pomocą HPTLC. To łatwe i proste podejście stanowi alternatywną metodę wiarygodnego badania przesiewowego witaminy C w próbkach żywności i napojów.

Zapewnia szybką, ekonomiczną i prostą półilościową analizę kwasu askorbinowego i kwasu dehydroksyaskorbinowego, a także demonstruje główne zalety metody TLC, takie jak szybkie przygotowanie próbki, wysoka tolerancja matrycy i wysoka przepustowość.

Aby dowiedzieć się więcej na temat zastosowań do testowania żywności zobacz SigmaAldrich.com/food.

Referencje

1. United States Pharmacopeia (2022). USP Monographs Dietary Supplement Monographs NF Monographs, Ascorbic Acid. USP-NF. Rockville, MD: United States Pharmacopeia. https://doi.org/10.31003/uspnf_m6030_04_01

2. Schulz M, Oberle M, Burholt M, Baeumle M. 50 years of TLC-MS Thin-Layer Chromatography coupled to Mass Spectrometry and new perspectives by complementary use to HPLC as demonstrated in testing of honey Analytix Reporter. 2019;5: 3-7. [Internet]. Available from: https://www.sigmaaldrich.com/analytix

3. Unpublished results. Contact the author to get more details.