Analityczne kolumny SEC do separacji biomolekuł

Cory E. Muraco, Hillel Brandes, Stacy Shollenberger

Reporter US Volume 34.3

Co to jest chromatografia wykluczania wielkości?

Chromatografia wykluczania wielkości (SEC) to tryb chromatografii, który oddziela cząsteczki zgodnie z ich promieniem hydrodynamicznym. Faza stacjonarna składa się z kulistych, porowatych cząstek o dokładnie kontrolowanej wielkości porów, przez które dyfundują cząsteczki, w oparciu o ich różnicę wielkości, przy użyciu buforu wodnego jako fazy ruchomej. SEC jest entropowo kontrolowanym procesem separacji, w którym anality są "filtrowane", a nie zatrzymywane na kolumnie poprzez interakcje chemiczne między fazą stacjonarną a specyficznymi grupami funkcyjnymi analitu.

Kluczowe jest zminimalizowanie resztkowych interakcji silanolu z faz stacjonarnych opartych na krzemionce, ponieważ interakcja ta powoduje ogonowanie pików analitu. Problem ten nasila się, gdy mamy do czynienia z większymi biomakromolekułami.^1,2 W SEC, współczynniki retencji (k) można obliczyć badając objętości wymagane do elucji analitu (V_e) i objętość międzywęzłową (V_i). Objętość śródmiąższowa to objętość analitu, który w pełni przenika przez pory cząsteczki. Dlatego k można obliczyć za pomocą równania 1.³

k = (V_e-V_i) / V_i
(1)

Oszacowanie masy cząsteczkowej przy użyciu kolumn do chromatografii wykluczania

SEC można również wykorzystać do oszacowania masy cząsteczkowej nieznanego analitu poprzez utworzenie krzywej kalibracyjnej przy użyciu wzorców o znanej masie cząsteczkowej. Wykreślając logarytm M (logarytm masy cząsteczkowej) względem Ve, generowany jest wielomian trzeciego rzędu. Obszar liniowy w obrębie tego wielomianu zapewnia najwyższą rozdzielczość i dokładność masy dla danej kolumny. Nachylenie linii w liniowej części krzywej kalibracyjnej jest miarą selektywności fazy stacjonarnej. Podstawiając wcześniej wspomniane warunki do ogólnego równania dla linii liniowej, otrzymujemy równanie 2.⁴

log M= m * KD+b
(2)

gdzie KD jest stałą rozkładu dla danego analitu

W miarę jak rozkład wielkości porów cząstki staje się węższy, nachylenie staje się płytsze, co skutkuje większą selektywnością analitów o podobnej masie cząsteczkowej. Przykład typowej krzywej kalibracyjnej SEC, wykorzystującej nową kolumnę SEC sub-2 μM firmy Sepax, przedstawiono na Rysunku 1.⁵ W dziedzinie chromatografii obserwuje się silny trend w kierunku opracowywania metod zoptymalizowanych pod kątem wysokiej wydajności. Wysoka przepustowość jest szczególnie ważna w przemyśle farmaceutycznym, gdzie setki próbek są analizowane codziennie w laboratoriach kontroli jakości (QC). Dłuższe czasy pracy kosztują potencjalną firmę pieniądze pod względem zużycia fazy ruchomej, czasu pracy urządzenia i zużycia energii. Ogólnie rzecz biorąc, istnieją trzy sposoby na skrócenie czasu pracy w metodzie chromatograficznej: zwiększenie natężenia przepływu, zwiększenie temperatury kolumny lub zmniejszenie długości kolumny. W przypadku SEC biomolekuł, zwiększenie szybkości przepływu spowoduje poszerzenie piku wraz z towarzyszącym wzrostem przeciwciśnienia, co zostało zilustrowane na nałożonych chromatogramach na Rysunku 2.

Rysunek 1. Krzywa kalibracji SEC przy użyciu kolumny Sepax Unix SEC-300

Rysunek 2. Nałożone chromatogramy pokazujące wpływ natężenia przepływu na wydajność chromatograficzną

Szybkość i wydajność kolumn do chromatografii wykluczania

Innym sposobem na skrócenie czasu działania metody jest zwiększenie temperatury kolumny. W przypadku biomolekuł głównym wyzwaniem w uzyskaniu szybkich i wysokorozdzielczych separacji w SEC jest powolny transfer masy analitów między przestrzenią śródmiąższową kolumny a przestrzenią porów fazy stacjonarnej. Zwiększając temperaturę, lepkość fazy ruchomej zmniejsza się, a kinetyka analitów wzrasta, zwiększając w ten sposób szybkość transferu masy analitów.⁶ Podwyższone temperatury mogą jednak powodować agregację i fragmentację białek, zwłaszcza białek z elastycznymi regionami w ich strukturze trzeciorzędowej.

Ostatnie postępy w technologii kolumn umożliwiły produkcję kolumn wypełnionych mniejszymi cząstkami o średnicy 2 μM lub mniejszej. Teoria chromatografii przewiduje, że mniejszy rozmiar cząstek prowadzi do węższych pików ze względu na lepszą wydajność kolumny. Czynnikiem ograniczającym stosowanie kolumn o małych rozmiarach cząstek jest wzrost przeciwciśnienia, który towarzyszy tym kolumnom. Ponadto, jedno z badań sugeruje, że ze względu na wysokie ciśnienie generowane przez te kolumny, ogrzewanie cierne może powodować agregację na kolumnie lub denaturację białek wrażliwych na temperaturę, choć nie zostało to szeroko opisane w literaturze.⁷

Sepax i Tosoh Biosciences, wykorzystując wysoką wydajność kolumn wypełnionych mniejszymi cząstkami, stworzyły dwie nowe linie kolumn: Unix™ SEC-300 i TSKgel^® UP-SW3000 odpowiednio. Kolumna Unix to w pełni porowata kolumna SEC 1,8 μM z porami 300 Å. Ze względu na duży rozmiar porów i mały rozmiar cząstek, kolumna Unix jest zoptymalizowana do wykonywania szybkich i wydajnych separacji białek i innych dużych biomolekuł. Rysunki 3 i 4 ilustrują zalety stosowania kolumn wypełnionych cząstkami o wielkości poniżej 2 μM.

Jak wynika z dyskusji i przykładów podanych powyżej, stosowanie kolumn wypełnionych cząstkami o wielkości poniżej 2 μM zapewnia znaczny wzrost wydajności w porównaniu z kolumnami SEC wypełnionymi większymi cząstkami. Ze względu na tę "przewagę małych cząstek", krótsze kolumny mogą być stosowane do zastosowań analitycznych, co prowadzi do oszczędności kosztów dla użytkownika końcowego bez obawy o pogorszenie wyników analizy chromatograficznej.

Rysunek 3. Przewaga szybkości wynikająca z zastosowania kolumn wypełnionych cząsteczkami o wielkości poniżej 2 μM

Rysunek 4. Korzyści w zakresie wydajności wynikające z zastosowania kolumn wypełnionych cząsteczkami o wielkości poniżej 2 μM

Referencje

1. Fekete S, Beck A, Veuthey J, Guillarme D. 2014. Theory and practice of size exclusion chromatography for the analysis of protein aggregates. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 101161-173. https://doi.org/10.1016/j.jpba.2014.04.011

2. Barth HG. 2012. et al. LCGC North America.(30):544-563.

3. Engelhardt H, Ahr G. 1983. Optimization of efficiency in size-exclusion chromatography. Journal of Chromatography A. 282385-397. https://doi.org/10.1016/s0021-9673(00)91616-9

4. Hong P, Koza S, Bouvier ESP. 2012. A REVIEW SIZE-EXCLUSION CHROMATOGRAPHY FOR THE ANALYSIS OF PROTEIN BIOTHERAPEUTICS AND THEIR AGGREGATES. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. 35(20):2923-2950. https://doi.org/10.1080/10826076.2012.743724

5. Kopaciewicz W, Regnier F. 1982. Nonideal size-exclusion chromatography of proteins: Effects of pH at low ionic strength. Analytical Biochemistry. 126(1):8-16. https://doi.org/10.1016/0003-2697(82)90102-6

6. Das T. 2008. et al. American Pharmaceutical Review.(11):54-57.

7. Vajda J, Römling R. 2012. New approaches to hplc analysis of antibody aggregates and fragments Chromatogr. Today.(5):44-17.