Zastosowanie odczynników do derywatyzacji w chromatografii gazowej (GC)

Jay Jones, Katherine Stenerson

Reporter US Edition 25.1

Wprowadzenie

Zakres analitów jest nieco ograniczony, jeśli chodzi o analizę GC w porównaniu z innymi technikami, takimi jak HPLC. Kilka przyczyn tego stanu rzeczy można przypisać związkom o niskiej lub zerowej lotności lub związkom o słabej stabilności termicznej. Podejściem do przezwyciężenia tych problemów jest modyfikacja analitu do postaci bardziej "podatnej na GC", przy użyciu procesu derywatyzacji.

BSTFA + TMCS jako odczynnik derywatyzacyjny dla GC

Derywatyzacja jest techniką, która zwykle obejmuje reakcję analitu(ów) będącego przedmiotem zainteresowania z konkretnym odczynnikiem derywatyzacyjnym. Istnieje wiele odczynników, które mogą być stosowane w zależności od charakteru i funkcjonalności analitów. Jeden z najczęściej stosowanych w analizach GC obejmuje reakcję, która dodaje trimetylosililową (TMS) grupę funkcyjną do związku. Jest to również znane jako trimetylosililowanie. Odczynnik N,Obis( trimetylosililo)trifluoroacetamid (zwany również BSTFA) jest regularnie używany do tej reakcji.

Łatwość derywatyzacji różnych grup funkcyjnych dla danego odczynnika sililującego jest następująca: alkohol > fenol > kwas karboksylowy > amina > amid. W ramach tej sekwencji, na reaktywność w stosunku do konkretnego odczynnika sililującego będzie miała również wpływ przeszkoda steryczna. Dlatego łatwość reaktywności dla alkoholi jest następująca: pierwszorzędowe > drugorzędowe > trzeciorzędowe, a dla amin: pierwszorzędowe > drugorzędowe.

Dla umiarkowanie utrudnionych lub wolno reagujących związków, do BSTFA można dodać katalizator. Niektóre z bardziej powszechnych katalizatorów to trimetylochlorosilan (zwany także TMCS), kwas trifluorooctowy, chlorowodór, octan potasu, piperydyna, chlorowodorek O-metylohydroksyloaminy i pirydyna.

Uwagi dotyczące procedury derywatyzacji

Podczas przeprowadzania reakcji derywatyzacji należy wziąć pod uwagę kilka parametrów. Na przykład, alkohol może ulec pełnej derywatyzacji w ciągu zaledwie kilku minut w temperaturze pokojowej. Jednak zakończenie reakcji amidu lub kwasu karboksylowego z przeszkodami sterycznymi może zająć godziny w podwyższonej temperaturze.

Oprócz czasu i temperatury ważne jest stężenie odczynnika. Zaleca się dodawanie odczynnika sililującego w nadmiarze. Ogólną zasadą jest dodawanie BSTFA w stosunku molowym co najmniej 2:1 do aktywnych wodorów.

Większość reakcji derywatyzacji jest wrażliwa na wodę. Obecność wody może spowolnić lub całkowicie zatrzymać reakcję. Wilgoć może również rozkładać odczynnik TMS lub powstałe pochodne. Dlatego zaleca się przechowywanie odczynników do derywatyzacji w dodatkowym pojemniku zawierającym środek osuszający. Dodatkowo należy usunąć wilgoć z ekstraktu, który ma być derywatyzowany.

Przykłady derywatyzacji

Bez derywatyzacji, związki estrogenowe i amid kwasu lizergowego (LSD) wykazują niewielką lub żadną reakcję w analizie GC. Po dodaniu grupy TMS anality te wykazują doskonały kształt piku i odpowiedź. Poniższe akapity szczegółowo opisują kroki podjęte w celu zapewnienia, że reakcje derywatyzacji zostaną zakończone poprzez manipulowanie wyżej wymienionymi rozważaniami dotyczącymi procedury.

Z czterech związków estrogenowych, trzy zostały w pełni derywatyzowane w ciągu 30 minut w temperaturze 75 °C. Jednak estriol wydawał się mieć tylko dwa z aktywnych hydrogenów sililowanych w ciągu 30 minut (zgodnie z danymi spektralnymi uzyskanymi z analizy GC-MS). Ekstrakt poddano derywatyzacji po raz drugi w temperaturze 75 °C. Dodatkowo, czas reakcji został wydłużony do 45 minut. Po pozostawieniu na noc w temperaturze pokojowej, analiza GC-MS potwierdziła, że wszystkie trzy aktywne hydrogeny zostały zastąpione grupami TMS. Rysunek 1 przedstawia końcowy chromatogram.

Rysunek 1. Analiza GC związków estrogennych

Amid kwasu lizergowego (LSD) derywatyzowano w podobnych warunkach jak związki estrogenowe, ale w temperaturze 68 °C. Próbki z tej reakcji pobierano w odstępach 30-minutowych. W tej temperaturze reakcja nigdy nie przekroczyła 60%, nawet po 5 godzinach. Następnie temperaturę zwiększono do 75 °C. Podwyższona temperatura spowodowała, że reakcja została zakończona w około 95%. Nawet po prawie trzech godzinach zarówno pik LSD, jak i LSD (TMS) są nadal wykrywane przez analizę GC, co oznacza, że reakcja nie została zakończona w 100%. Ten chromatogram jest pokazany na Rysunku 2.

Rysunek 2. Analiza GC LSD-TMS

Wnioski

Reakcje derywatyzacji pozwalają na rozszerzenie zakresu analitów, które mogą być analizowane za pomocą GC. Istnieje jednak kilka parametrów, które mogą wymagać prób i błędów w celu optymalizacji reakcji. W przedstawionych przykładach zarówno temperatura, jak i czas miały kluczowe znaczenie dla zakończenia reakcji. Te dwa przykłady ilustrują, że każda reakcja derywatyzacji musi być zoptymalizowana, aby osiągnąć wysoki procent zakończenia derywatyzacji, co skutkuje dobrym kształtem piku i odpowiedzią detektora.

Referencje

1. Knapp DR. 1979. Handbook of Analytical Derivatization Reactions, John Wiley & Sons, New York..