Derywatyzacja i analiza aminokwasów za pomocą GC-MS

Katherine K. Stenerson

Reporter US Volume 25.3

Wprowadzenie

Zazwyczaj do analizy aminokwasów stosuje się wysokosprawną chromatografię cieczową (HPLC). Jednak GC może być również stosowana, a w niektórych przypadkach dostępność oprzyrządowania lub koszty operacyjne mogą sprawić, że będzie to lepszy wybór. Polarny charakter aminokwasów wymaga derywatyzacji przed analizą GC. Celem derywatyzacji jest uczynienie analitu bardziej lotnym, mniej reaktywnym, a tym samym poprawa jego zachowania chromatograficznego. W przypadku aminokwasów derywatyzacja zastępuje aktywne wodory w polarnych grupach funkcyjnych OH, NH2 i SH niepolarną grupą funkcyjną.

Przegląd sekcji

• Experimental
• Wyniki
• Wnioski
• Referencje

Sililowanie jest bardzo powszechną techniką derywatyzacji i jest przydatne dla szerokiej gamy związków. Główną wadą tej metody jest jej wrażliwość na wilgoć. Obecność wilgoci powoduje słabą wydajność reakcji i niestabilność derywatyzowanych analitów. W tym badaniu oceniliśmy zastosowanie odczynnika sililującego N-tert-butylodimetylosililo-N-metylotrifluoroacetamidu (MTBSTFA) do derywatyzacji aminokwasów. MTBSTFA tworzy pochodne tert-butylowo-dimetylosililowe (TBDMS) w reakcji z polarnymi grupami funkcyjnymi zawierającymi aktywny wodór:

Rysunek 1. Struktura MTBSTFA

Pochodne MTBSTFA są bardziej stabilne i mniej wrażliwe na wilgoć niż te utworzone przy użyciu odczynników o niższej masie cząsteczkowej, takich jak N,O-bis(trimetylosililo)trifluoroacetamid (BSTFA) (1).

Experimental

Podwielokrotność 50 μL roztworu zawierającego mieszaninę L-aminokwasów o stężeniu 91 μg/mL w 0.1 N HCl osuszono i dodano 100 μL czystego MTBSTFA, a następnie 100 μL acetonitrylu. Mieszaninę ogrzewano w temperaturze 100 °C przez 4 godziny. Następnie próbkę zneutralizowano wodorowęglanem sodu i poddano analizie GC-MS na kolumnie kapilarnej SLB™-5ms o wymiarach 20 m x 0,18 mm I.D. x 0,18 μm.

Wyniki

Chromatogram pochodnych TBDMS aminokwasów przedstawiono na Rysunku 2. Dane spektralne uzyskane z pików pomogły w identyfikacji pochodnych aminokwasów. Zastąpienie aktywnego wodoru grupą TBDMS zwiększa masę cząsteczkową o 114. Widma zderzeniowe elektronów (2) tych pochodnych zawierają typowe fragmenty odpowiadające masie cząsteczkowej pochodnej pomniejszonej o CH₃ (M-15), C₄H₉ (M-57), C₄H₉ + CO (M-85) i CO-O-TBDMS (M-159).Rysunek 3 pokazuje przykład tego wzoru fragmentacji w widmie TBDMS-waliny.

Rysunek 2. Analiza GC-MS pochodnych aminokwasów na SLB-5ms (28564-U)

Rysunek 3. Widmo masowe TBDMS pochodnej waliny (MW pochodnej = 345)

W zastosowanych warunkach reakcji większość aminokwasów wytworzyła jedną pochodną, z aktywnymi wodorami na grupach hydroksylowych, aminowych i tiolowych (w przypadku cysteiny) zastąpionymi przez TBDMS. Niektóre aminokwasy wytwarzały wiele pochodnych, w szczególności asparagina, glutamina i tryptofan. W przypadku tych aminokwasów, modyfikacja warunków reakcji, takich jak obniżenie temperatury lub zmiana czasu reakcji, może temu zapobiec (3). Na przykład wydłużenie czasu reakcji z 2 do 4 godzin spowodowało zwiększoną odpowiedź w pełni pochodnej formy tryptofanu.

Podczas gdy pochodne TBDMS są bardziej stabilne niż tradycyjne pochodne TMS, ich wyższe masy cząsteczkowe powodują dłuższe czasy elucji podczas analizy GC. Aby to zrównoważyć, separację przeprowadzono na krótkiej kolumnie kapilarnej o wąskim otworze. Temperatura początkowa nie wyższa niż 100 °C była konieczna do utrzymania rozdzielczości piku pochodnej glicyny od rozpuszczalnika. Po elucji pochodnej cystyny przeprowadzono szybką rampę do 360 °C, aby zapewnić czystość kolumny do kolejnych analiz.

Conclusion

Badanie to pokazuje, że przy właściwym użyciu odczynników derywatyzujących, takich jak MTBSTFA, aminokwasy mogą być analizowane za pomocą GC-MS. Warunki reakcji mogą wymagać "dostosowania" w celu uzyskania maksymalnej odpowiedzi pochodnych będących przedmiotem zainteresowania. Pochodne wytwarzają charakterystyczne fragmenty, co pozwala na łatwą identyfikację za pomocą MS. Aby skrócić całkowity czas analizy GC tych pochodnych, zaleca się stosowanie krótkiej kolumny o wąskim otworze, takiej jak SLB-5ms 20 m x 0,18 mm I.D. x 0,18 μm.

Referencje

1. Sobolevsky TG, Revelsky AI, Miller B, Oriedo V, Chernetsova ES, Revelsky IA. 2003. Comparison of silylation and esterification/acylation procedures in GC-MS analysis of amino acids. J. Sep. Science. 26(17):1474-1478. https://doi.org/10.1002/jssc.200301492

2. Kitson FG, Larsen BS, McEwen CN. Gas Chromatography and Mass Spectrometry, A Practical Guide; Academic Press: San Diego, 1996; Chapter 9..

3. Molnár-Perl I, Katona ZF. 2000. GC-MS of amino acids as their trimethylsilyl/t-butyldimethylsilyl Derivatives: In model solutions III. Chromatographia. 51(1):S228-S236. https://doi.org/10.1007/bf02492811