Oczyszczanie białek znakowanych histydyną przy użyciu TALON^® Superflow

TALON^® Superflow składa się z wysoce usieciowanych kulek agarozowych z unieruchomioną grupą chelatującą wstępnie naładowaną jonami Co²⁺ .

Środek wiąże białka znakowane polihistydyną z wysoką selektywnością i wykazuje zmniejszone powinowactwo do białek gospodarza, dając niższe tło w porównaniu z innymi środkami IMAC. Pożywka jest kompatybilna z wieloma buforami wodnymi, denaturantami i szeregiem innych dodatków (Załącznik 1, Charakterystyka produktów Ni Sepharose, Ni Sepharose excel, TALON^® Superflow i nienaładowanej IMAC Sepharose). Należy unikać stosowania DTT (ditiotreitolu), DTE (ditioerytrytolu) i TCEP (TRIS (2-karboksyetylo) fosfiny) z produktami TALON^® Superflow. Zdolność wiązania białek gwałtownie spadnie, jeśli zostanie użyta. Pożywka nadaje się do oczyszczania wsadowego i może być również stosowana do pakowania w kolumny do chromatografii cieczowej, takie jak kolumny Tricorn lub XK. Pożywka zwykle dobrze współpracuje z protokołami zaprojektowanymi dla kolumn IMAC opartych na Ni²⁺.

Rysunek 3.37. TALON® Superflow pozwala na oczyszczanie białek w warunkach natywnych lub denaturujących i może być stosowany z prokariotycznymi i eukariotycznymi systemami ekspresji. TALON® Superflow jest dostępny w pojemnościach 10 i 50 ml.

Przygotowanie próbki

Ta procedura przygotowania próbki ma zastosowanie do wszystkich formatów zawierających TALON^® Superflow. Ogólny opis znajduje się w Cell lysis wcześniej w tym rozdziale.

Dostosować próbkę do składu i pH buforu wiążącego przez dodanie buforu, NaCl, imidazolu i dodatków ze stężonych roztworów podstawowych; przez rozcieńczenie próbki buforem wiążącym; lub przez wymianę buforu.

Przepuścić próbkę przez filtr 0,22 µm lub 0,45 µm i/lub odwirować bezpośrednio przed zastosowaniem próbki. Filtracja nie jest konieczna w przypadku stosowania HiTrap TALON^® crude i His GraviTrap. Jeśli próbka jest zbyt lepka, należy ją rozcieńczyć buforem wiążącym, zwiększyć intensywność lizy (sonikacja, homogenizacja) lub dodać DNazę/RNazę w celu zmniejszenia wielkości fragmentów kwasu nukleinowego.

Przygotowanie buforu

Bufor wiążący:	50 mM fosforan sodu, 300 mM NaCl, pH 7.4
Bufor płuczący:	50 mM fosforan sodu, 300 mM NaCl, 5 mM imidazol, pH 7.4
Bufor elucyjny:	50 mM fosforan sodu, 300 mM NaCl, 150 mM imidazol, pH 7,4

Woda i chemikalia używane do przygotowania buforów powinny być wysokiej czystości. Przed użyciem bufory należy przefiltrować przez filtr 0,45 µm. Należy stosować imidazol o wysokiej czystości, który zasadniczo nie daje absorbancji przy 280 nm.

Niespecyficzne wiązanie białek z powodu oddziaływań elektrostatycznych można zmniejszyć, zwiększając stężenie NaCl do 500 mM.

Stężenie imidazolu wymagane do płukania i elucji zależy od białka. Rozdział 4 (Optymalizacja oczyszczania białek znakowanych histydyną) w celu uzyskania dalszych informacji.

Pakowanie kolumn

TALON^® Superflow jest dostarczany wstępnie spęczniony w 20% etanolu. Przygotuj zawiesinę, dekantując 20% roztwór etanolu i zastępując go wodą destylowaną w stosunku 75% osiadłego medium do 25% wody destylowanej.

1. Zamontuj kolumnę (i zbiornik uszczelniający, jeśli to konieczne).
2. Usuń powietrze z końcówki i adaptera, przepłukując je wodą. Upewnij się, że powietrze nie zostało uwięzione pod wspornikiem kolumny. Zamknij wylot kolumny, pozostawiając wspornik złoża pokryty wodą.
3. Zawieś ponownie medium i wlej zawiesinę do kolumny jednym ciągłym ruchem. Wlewanie zawiesiny po szklanym pręcie przytrzymywanym przy ścianie kolumny zminimalizuje wprowadzanie pęcherzyków powietrza.
4. Jeśli używasz zbiornika uszczelniającego, natychmiast wypełnij pozostałą część kolumny i zbiornika wodą. Zamontuj adapter lub pokrywę zbiornika uszczelniającego i podłącz kolumnę do pompy. Unikaj uwięzienia pęcherzyków powietrza pod adapterem lub w rurce wlotowej.
5. Otwórz dolny wylot kolumny i ustaw pompę na pracę z żądaną prędkością przepływu. Powinno to wynosić co najmniej 133% szybkości przepływu, która będzie używana podczas kolejnych procedur chromatograficznych. Jednak maksymalna szybkość przepływu jest zwykle stosowana podczas pakowania.

Dla kolejnych procedur chromatograficznych nie należy przekraczać 75% szybkości przepływu pakowania.

10.  Utrzymać szybkość przepływu przez co najmniej 3 objętości złoża po osiągnięciu stałej wysokości złoża. Zaznaczyć wysokość złoża na kolumnie.
11.  Zatrzymać pompę i zamknąć wylot kolumny.
12. Jeśli używany jest zbiornik szczeliwa, odłączyć zbiornik i przymocować adapter do kolumny.
13. Po odłączeniu wlotu adaptera, wcisnąć adapter w dół do kolumny, aż osiągnie oznaczenie. Pozwól, aby roztwór uszczelniający wypłukał wlot adaptera. Zablokować adapter na miejscu.
14.  Podłączyć kolumnę do pompy lub systemu chromatograficznego i rozpocząć wyrównywanie. W razie potrzeby ponownie wyreguluj adapter.

Dla kolejnych procedur chromatograficznych nie przekraczaj 75% szybkości przepływu opakowania.

Purifikacja
Procedura oczyszczania kolumny z wypełnieniem

1. Jeśli kolumna zawiera 20% etanolu, przemyj ją 5 objętościami wody destylowanej. Użyj prędkości przepływu od 50 cm/h do 100 cm/h. Załącznik 8 w celu uzyskania informacji na temat przeliczania prędkości przepływu (cm/h) na objętościową szybkość przepływu (ml/min).
2. Kolumnę należy wyrównać za pomocą 5 do 10 objętości złoża buforu wiążącego. Zalecana prędkość przepływu: 150 cm/h.

W niektórych przypadkach zaleca się wykonanie ślepej próby przed ostatecznym wyrównaniem/aplikacją próbki.

3. Zastosuj wstępnie przygotowaną, przefiltrowaną lub odwirowaną próbkę.
4. Płucz buforem płuczącym, aż absorbancja osiągnie wartość wyjściową.
5. Elucja buforem elucyjnym przy użyciu gradientu stopniowego lub liniowego. W przypadku stopniowej elucji, zwykle wystarcza 8 objętości buforu elucyjnego. Płytki gradient, na przykład gradient liniowy w 20 objętościach złoża, może oddzielić białka o podobnej sile wiązania.

Pusty przebieg:
Wyciek Co²⁺ z TALON^® Superflow jest niski we wszystkich normalnych warunkach. W przypadku bardzo krytycznych zastosowań wyciek podczas oczyszczania można jeszcze bardziej ograniczyć, wykonując ślepą próbę przed załadowaniem próbki.

1. Przepłukać kolumnę 5 objętościami wody destylowanej.
2. Przepłukać kolumnę 5 objętościami buforu elucyjnego.
3. Kwilibrować kolumnę 10 objętościami buforu wiążącego.