Optymalizacja oczyszczania białek znakowanych histydyną

W niniejszym rozdziale omówiono trzy metody optymalizacji oczyszczania białek znakowanych histydyną w celu osiągnięcia wysokiej czystości:

• Optymalizacja przy użyciu imidazolu
• Optymalizacja przy użyciu różnych jonów metali
• Optymalizacja przy użyciu wieloetapowych oczyszczeń

Dla ogólnego oczyszczeniaoczyszczania białek znakowanych histydyną, w tym typowego sposobu pracy, opisów dostępnych mediów chromatograficznych i formatów produktów, procedur i wskazówek dotyczących rozwiązywania problemów, patrz Rozdział 3.

Optymalizacja przy użyciu imidazolu

Obecność powierzchniowo eksponowanych reszt histydynowych lub innych aminokwasów tworzących kompleksy może prowadzić do niepożądanego wiązania nieoznakowanych białek komórek gospodarza z mediami oczyszczającymi. Te nieoznakowane białka mogą eluować wraz z białkiem docelowym. Zdolność wiązania tych zanieczyszczeń jest często niższa niż znakowanych białek rekombinowanych; dlatego też może być możliwe ich usunięcie poprzez optymalizację warunków separacji.

Poniższe przykłady pokazują, w jaki sposób zmiany stężenia imidazolu podczas wiązania wpływają na czystość białka docelowego znakowanego histydyną.

Przy stosowaniu produktów Ni Sepharose^® excel i TALON^® Superflow zwykle nie zaleca się dodawania imidazolu podczas wiązania.

1. Imidazol jako środek konkurencyjny

Imidazol jest stosowany jako środek konkurencyjny do elucji białek znakowanych histydyną. Ponadto, imidazol może być dodawany w niskich stężeniach do próbki i buforu wiążącego w celu zmniejszenia wiązania zanieczyszczających białek, a tym samym zwiększenia końcowej czystości.

Kinaza białkowa G znakowana histydyną [(His)₆-PknG] z Mycobacterium bovis została oczyszczona przy użyciu stężenia 45 mM imidazolu w próbce i buforze wiążącym. Podłoże użyte w eksperymencie to Ni Sepharose^® High Performance (Rozdział 3, Purification using Ni Sepharose^® High Performance).

Aby uzyskać wyższe stężenie białka, białko eluowano w gradiencie stopniowym (Rysunek 4.1A). Aby zademonstrować korzystny wpływ imidazolu podczas wiązania, przeprowadzono dodatkowe oczyszczanie w tych samych warunkach, z wyjątkiem pominięcia imidazolu (Rysunek 4.1B). Należy zauważyć, że pominięcie imidazolu nie jest ogólnie zalecane w przypadku Ni Sepharose^® High Performance lub Ni Sepharose^® 6 Fast Flow; przykład ten podano wyłącznie w celu wykazania negatywnego wpływu jego braku na czystość eluowanego białka docelowego.

SDS-PAGE połączonych frakcji elucyjnych wykazał znaczną poprawę czystości białka docelowego, gdy 45 mM imidazol został włączony do próbki i buforu wiążącego (Rysunek 4.1C). Wydajność białka docelowego została w tym przypadku utrzymana w próbce z obecnością 45 mM imidazolu. Należy pamiętać, że optymalne stężenie imidazolu zależy od białka i dlatego musi być ustalane indywidualnie dla każdego przypadku.

Rysunek 4.1. Oczyszczanie (His)6-PknG bez (A) i z (B) 45 mM imidazolem w próbce i buforze wiążącym. Dla każdego chromatogramu lizat 2 l hodowli E. coli (objętość próbki 26 ml; filtrowany przez filtr strzykawkowy 0,45 µm) został załadowany na kolumnę Ni Sepharose® High Performance o objętości 2 ml (kolumna XK 16/20) przy użyciu systemu chromatografii ÄKTApurifier (obecnie zastąpionego przez ÄKTA pure). Kinazę eluowano w dwuetapowym gradiencie z 50% i 100% buforem elucyjnym. (C) SDS-PAGE (12% żel) frakcji (His)6-PknG pokazujący eluaty bez (-) i z (+) 45 mM imidazolem w buforze wiążącym. Dane uprzejmie dostarczone przez K. Hölscher, M. Richter-Roth i B. Felden de Neuman, GPC Biotech AG, Martinsried, Niemcy.

2. Określanie optymalnego stężenia imidazolu przy użyciu His SpinTrap

Stężenie imidazolu podczas wiązania i płukania jest ważnym czynnikiem wpływającym na końcową czystość i wydajność białka docelowego. His SpinTrap jest wygodnym i szybkim narzędziem do określania optymalnego stężenia imidazolu. Optymalizacja jest ważna zarówno dla czystości, jak i wydajności białka docelowego. Zostało to zademonstrowane w serii eksperymentów, w których białko znakowane histydyną, APB7-(His)₆ (M_r 28 000), zostało oczyszczone na His SpinTrap przy użyciu 5, 50, 100 lub 200 mM imidazolu w buforze do próbek i buforze wiążącym. Bufor elucyjny zawierał 500 mM imidazolu.

Stężenie imidazolu 5 mM skutkowało niską czystością eluowanej próbki (Rys. 4.2, pas 3), podczas gdy wzrost do 50 mM imidazolu zapobiegał wiązaniu większości zanieczyszczeń i poprawiał czystość (Rys. 4.2, pas 4). Dodanie 100 mM imidazolu do próbki i buforu wiążącego obniżyło wydajność, podczas gdy czystość została nieznacznie poprawiona (Rysunek 4.2, pas 5). Niższą wydajność można wytłumaczyć mniejszym wiązaniem białka docelowego ze względu na konkurencyjny efekt wysokiego stężenia imidazolu podczas wiązania i płukania. Dalszy wzrost do 200 mM imidazolu jeszcze bardziej zmniejszył wydajność (Rysunek 4.2, pas 6).

Przykład ten pokazuje, że wyższe stężenia imidazolu podczas wiązania poprawiają czystość, podczas gdy zbyt wysokie stężenie zmniejsza wydajność. Optymalne stężenie imidazolu podczas wiązania zależy od białka. Dla wielu białek, 20 do 40 mM imidazolu jest najlepszym wyborem dla His SpinTrap.

Rysunek 4.2. SDS-PAGE w warunkach redukujących (ExcelGel SDS Gradient 8-18) białka APB7 znakowanego histydyną. Stężenie imidazolu podczas wiązania wpływa na końcową czystość i wydajność (porównaj pasy 3, 4, 5 i 6).

Optymalizacja przy użyciu różnych jonów metali

Na siłę wiązania między białkiem a jonem metalu wpływa kilka czynników, w tym struktura i charakterystyka białka docelowego, obecność i właściwości znacznika powinowactwa białka, właściwości jonu metalu oraz pH i skład buforu wiążącego. W rezultacie Ni²⁺, jon metalu uważany za mający najsilniejsze powinowactwo do białek znakowanych histydyną, może nie zawsze być najlepszym wyborem dla danego zastosowania. Dlatego w pewnych okolicznościach inne jony metali przejściowych, takie jak Co²⁺, Cu²⁺, Fe²⁺ i Zn²⁺, mogą być lepiej dopasowane.

Ogólnie rzecz biorąc, zalecamy stosowanie wysokowydajnych podłoży chromatograficznych Ni Sepharose^® High Performance lub Ni Sepharose^® 6 Fast Flow, wstępnie naładowanych jonami Ni²⁺ w celu uzyskania wysokiej wydajności. Jeśli korzystna jest zwiększona selektywność i wyższa czystość, dobrym wyborem jest TALON^® Superflow, wstępnie naładowany jonami Co²⁺. W celu uzyskania zmienionej selektywności, inne jony metali mogą być testowane przy użyciu nienaładowanej IMAC Sepharose^® High Performance lub IMAC Sepharose^® 6 Fast Flow.

Następujące wytyczne mogą pomóc w opracowaniu wstępnych eksperymentów w celu określenia jonu metalu najbardziej odpowiedniego dla danej separacji:

• Ni²⁺ jest zwykle stosowany do białek rekombinowanych znakowanych histydyną.

• Co²⁺ jest również używane do oczyszczania białek znakowanych histydyną, ponieważ może pozwolić na słabsze wiązanie i zmniejszyć ilość zanieczyszczeń, które mogą się wiązać.

• Cu²⁺ i Zn²⁺ są często używane do oczyszczania nieoznakowanych białek. Cu²⁺ zapewnia stosunkowo silne wiązanie z szeregiem białek; niektóre białka wiążą się tylko z Cu²⁺. Jony Zn²⁺ często wiążą się słabiej, co jest często wykorzystywane do osiągnięcia selektywnej elucji białka docelowego. Zarówno Cu²⁺ jak i Zn²⁺ mogą być stosowane do białek znakowanych histydyną i do separacji na skalę procesową.

• Fe³⁺ jest stosowany rzadziej niż inne jony metali. Podczas pracy z Fe³⁺ należy zachować dodatkowe środki ostrożności, ponieważ łatwo ulega on redukcji w roztworach obojętnych. Fe³⁺ jest często używany do oczyszczania fosfopeptydów, ponieważ grupa fosforanowa ma silne powinowactwo do Fe³⁺. Chromatografia na unieruchomionym Fe³⁺ powinna być wykonywana przy pH <3, aby wyeliminować niespecyficzne oddziaływania z grupami karboksylowymi. Zalecamy również usuwanie unieruchomionych jonów Fe³⁺ po każdym przebiegu i ponowne ładowanie kolumny zgodnie z wymaganiami. Silnie związane jony Fe³⁺ i związki żelaza mogą być usunięte poprzez pozostawienie pożywki w 50 mM EDTA na noc.

Poniżej przedstawiamy dwa przykłady pokazujące, jak wybór najbardziej odpowiedniego jonu metalu i warunków eksperymentalnych (w tym stężenia imidazolu) wpływa na oczyszczanie danego białka docelowego.

1. Badanie porównawcze ²⁺, Zn²⁺ i Ni²⁺ na HiTrap IMAC FFusing Cu

.

W tym badaniu, APB7, białko znakowane (histydyną)₆ (M_r 28 000) wyrażone w E. coli BL-21, oczyszczono na kolumnach HiTrap IMAC FF 1 mL (wstępnie zapakowanych w IMAC Sepharose^® 6 Fast Flow) i ładowano oddzielnie Cu²⁺, Zn²⁺ i Ni²⁺.

Przeprowadzono eksperymenty przesiewowe w celu określenia optymalnego stężenia imidazolu dla każdego jonu [Rysunek 4.3 (A do C)]. Wyniki każdego z tych trzech oczyszczeń wskazują:

• Przy stężeniu imidazolu 20 mM nastąpił znaczny wyciek białka docelowego w płuczce z Cu²⁺ i Zn²⁺ (strzałki na Rysunku 4.3 A), co oznacza, że stężenie imidazolu było zbyt wysokie, aby umożliwić maksymalną wydajność. Bardzo niewielki wyciek zaobserwowano w przypadku Ni²⁺. Czystość była doskonała we wszystkich trzech przypadkach.

• Przy 10 mM imidazolu, wyciek białka docelowego w płuczce był znacznie zmniejszony dla Cu²⁺ i Zn²⁺. Czystość białka docelowego w eluowanej puli była podobna dla wszystkich trzech jonów metali, ale nie tak czysta jak przy 20 mM imidazolu.

• Przy 5 mM imidazolu nie wystąpił wyciek dla żadnego z jonów metali. Ni²⁺ zapewnił najczystsze białko, choć nadal nie tak czyste jak przy 20 mM imidazolu.

Należy zauważyć, że duża ilość próbki została zastosowana w żelu SDS-poliakryloamidowym. Z tego powodu żele wykazują szereg zanieczyszczeń w eluowanym materiale, mimo że czystość była bardzo wysoka.

Wyniki ilustrują, że dla dowolnego jonu metalu stężenie imidazolu można dostosować w celu uzyskania wysokiej wydajności, wysokiej czystości lub udanego kompromisu. Podłoże IMAC Sepharose^® zazwyczaj wymaga nieco wyższego stężenia imidazolu w buforze płuczącym niż podobne podłoża IMAC dostępne na rynku. Dobrym punktem wyjścia dla większości separacji jest dodanie od 20 do 40 mM imidazolu do buforów wiążących i płuczących przy użyciu IMAC Sepharose^® 6 Fast Flow lub IMAC Sepharose^® High Performance. Upewnij się, że używasz imidazolu o wysokiej czystości, który zasadniczo nie daje absorbancji przy 280 nm. Aby usunąć imidazol z białka, należy użyć kolumny do odsalania (Rozdział 11, Desalting/Buffer Exchange and Concentration).

Rysunek 4.3. Analizy SDS-PAGE (warunki redukujące) frakcji z oczyszczania APB7 przy użyciu IMAC Sepharose® 6 Fast Flow, zapakowanych w kolumny HiTrap IMAC FF 1 ml, naładowanych Cu2+, Zn2+ lub Ni2+ oraz (A) 20 mM imidazolem w próbce, (B) 10 mM imidazolem w próbce lub (C) 5 mM imidazolem w próbce. Żele zostały wybarwione Coomassie

2. Optymalizacja wpływu o²⁺, Zn²⁺, Co²⁺ i Ni²⁺ na czystość HiTrap IMAC HPf z wykorzystaniem Cu

Skuteczne oczyszczanie wymaga zwrócenia uwagi na właściwości białka docelowego i jego powinowactwo do użytego jonu metalu. Cztery różne kolumny HiTrap IMAC HP 1 m wstępnie wypełnione IMAC Sepharose^® High Performance zostały naładowane oddzielnie czterema różnymi jonami metali: Cu²⁺, Zn²⁺, Co²⁺ i Ni²⁺. Wydajność oczyszczania została oceniona przy użyciu docelowego białka APB7 (M_r 28 000), wyrażonego w E. coli.

Wyniki pokazują znaczenie badań przesiewowych próbek w celu określenia najbardziej odpowiednich jonów metali i warunków oczyszczania dla określonych białek docelowych. W przypadku APB7 najwyższą czystość uzyskano stosując Ni²⁺ lub Co²⁺, ale różnica w porównaniu z wynikami dla Zn²⁺ i Cu²⁺ była niewielka (Ryc. 4.4). Elucje gradientowe z imidazolem zastosowane w tych przykładach oferują również metodologię wyboru odpowiedniego stężenia imidazolu dla danego oczyszczania.

Rysunek 4.4. Oczyszczanie APB7, białka znakowanego (histydyną)6 wyrażonego w E. coli BL-21 na czterech różnych kolumnach HiTrap IMAC HP 1 ml naładowanych oddzielnie jonami metali. (A) Cu2+, (B) Zn2+, (C) Co2+ lub (D) Ni2+. Wskazano pule wybrane po SDS-PAGE poszczególnych frakcji 1 ml (nie pokazano). (E) Analiza SDS-PAGE: warunki redukujące na ExcelGel SDS Gradient 8-18; barwienie Coomassie.

Optymalizacja przy użyciu wieloetapowego oczyszczania

Białko docelowe może być dalej oczyszczane poprzez dodanie jednego lub więcej dodatkowych etapów oczyszczania, jak pokazano w poniższych przykładach. Temat ten został szczegółowo omówiony w rozdziale 9 (Chromatografia powinowactwa w strategii oczyszczania (C_IPP)).

Poniżej przedstawiamy dwa przykłady pokazujące udane wieloetapowe oczyszczanie białek docelowych.

1. Dwuetapowe oczyszczanie znakowanego ₁₀ białka przy użyciu AC i SECa o wysokiej masie cząsteczkowej (histydyna)

W dwuetapowym oczyszczaniu (His)₁₀-trx-p450 (znakowanego histydyną na N-końcu, 10 reszt histydynowych) produkowanego w E. coli, w pierwszym etapie zastosowano kolumnę HisTrap FF. Wymyta pula została następnie nałożona na kolumnę HiLoad 16/60 Superdex 200 pg w celu dalszego oczyszczenia przez SEC.

Trzy główne pasma zostały wykryte po pierwszym etapie oczyszczania (Rysunek 4.5B, pas 5). Pas 6 (pula 2 z SEC) zawiera białko docelowe o pełnej długości. Pasy 7 i 8 (odpowiednio pule 3 i 4) zawierają skrócone formy białka docelowego, zweryfikowane przez sekwencjonowanie N-końcowe (dane nie pokazane). Pas 9 (pula 1) z SEC zawiera zagregowane białka. Tak więc późniejszy SEC zapewnił bardzo dobrą separację między skróconymi formami a białkiem docelowym o pełnej długości, (His)₁₀-trx-p450.

Rysunek 4.5. (A) Dwuetapowe oczyszczanie białka o wysokiej masie cząsteczkowej znakowanego (histydyną)10 przy użyciu AC, a następnie SEC. (B) SDS-PAGE w warunkach redukujących i barwienie Coomassie.

2. Automatyczna trzystopniowa oczyszczanie nieklarowanego lizatu komórkowego na ÄKTAxpress

Zautomatyzowany trzystopniowy protokół został użyty do oczyszczenia znakowanego histydyną białka wiążącego maltozę ze 100 ml nieklarowanego lizatu komórkowego E. coli. coli lizatu komórkowego. Trzy etapy były następujące: Chromatografia afnitywna (AC) przy użyciu HisTrap FF crude (kolumna 1 mL), odsalanie (DS) przy użyciu HiPrep 26/10 Desalting i chromatografia jonowymienna (IEX) przy użyciu Mono Q™ 5/50 GL. Na obrazku są one określone jako AC-DS-IEX. Jak widać z analizy SDS-PAGE, docelowe białko uzyskano z wysoką czystością i dobrą wydajnością.

Rysunek 4.6. (A) AC-DS-IEX z powiększeniem pików IEX i zebranymi pulami po prawej stronie. Wydajność: 9,4 mg w pulach 1 + 2. (B) SDS-PAGE eluowanych pul z IEX. Żel został wybarwiony Coomassie.