Usuwanie znaczników przez enzymatyczne rozszczepienie
W większości przypadków testy funkcjonalne można przeprowadzić przy użyciu nienaruszonego białka znakowanego histydyną. Jeśli konieczne jest usunięcie znacznika, można zastosować procedury podobne do usuwania znacznika GST, to znaczy włączyć określone miejsca rozpoznawania, aby umożliwić późniejsze enzymatyczne rozszczepienie. Dokładne protokoły wymagane do rozszczepienia i oczyszczenia będą zależeć od oryginalnych wektorów i właściwości specyficznych enzymów stosowanych do rozszczepienia.
Proteaza rTEV (Invitrogen) ma znacznik (histydynowy)6 i rozpoznaje sekwencję aminokwasową Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln↓Gly. Glu, Tyr, Gln i Gly są potrzebne do rozszczepienia między resztami Gln i Gly (↓). N-końcowe (histydynowe)6-tagi mogą być usunięte. Zaletą tego enzymatycznego rozszczepienia jest to, że interesujące białko może być ponownie oczyszczone przy użyciu tego samego podłoża Ni Sepharose lub wstępnie zapakowanej kolumny. (histydyna)6-tag i (histydyna)6-tag proteazy rTEV będą wiązać się z kolumną, a interesujące białko może zostać zebrane w przepływie.
Ilość enzymu, temperatura i długość inkubacji wymagane do całkowitego trawienia różnią się w zależności od produkowanego specyficznie znakowanego białka. Określ optymalne warunki we wstępnych eksperymentach. Usunąć próbki w różnych punktach czasowych i przeanalizować za pomocą SDS-PAGE w celu oszacowania wydajności, czystości i stopnia trawienia. Przybliżone masy cząsteczkowe do analizy SDS-PAGE:
| r proteaza TEV arboksypeptydaza A* | Mr 29 000 nbsp; Mr 94 000 |
* do usuwania C-końcowych (histydynowych)6-tagów.
Niektóre procedury rozszczepiania wymagają drugiego etapu oczyszczania w celu usunięcia proteazy lub innych zanieczyszczeń. Konieczne będzie opracowanie konwencjonalnych technik separacji chromatograficznej, takich jak SEC (zwykle bez potrzeby optymalizacji), IEX lub HIC (Appendix 11, Zasady i standardowe warunki dla różnych technik oczyszczania).
Przykład zastosowania
Automatyczne usuwanie znaczników histydynowych przy użyciu ÄKTAxpress
Na następnej stronie przedstawiamy przykład automatycznego usuwania znaczników przy użyciu ÄKTAxpress.Wszystkie wieloetapowe protokoły oczyszczania w ÄKTAxpress można łączyć z automatycznym rozszczepianiem znaczników na kolumnie. Rozszczepienie znacznika jest zawsze przeprowadzane na kolumnie oczyszczającej przed dalszymi etapami oczyszczania. Gdy rozszczepione białko zostanie wymyte, kolumna czystości jest regenerowana, a znacznik czystości, znakowana proteaza i pozostałe nierozszczepione białko są zbierane w oddzielnym wylocie. Procedura obejmuje wiązanie znakowanego białka, wstrzykiwanie proteazy, inkubację, elucję rozszczepionego białka i zbieranie w pętli kapilarnej (pętlach kapilarnych), a następnie dalsze etapy oczyszczania.
Protokół czteroetapowy: białko znakowane (histydyną)6 rozszczepione proteazą AcTEV™
Przykład na Rys. 3.53 przedstawia wyniki oczyszczania białka znakowanego (histydyną)6, APC234 (Mr 32 500), wyrażonego w E. coli. Mr rozszczepionego produktu wynosi 30 000. Po zbiorze, liza komórek została przeprowadzona za pomocą sonikacji. Próbki zostały sklarowane przez odwirowanie przed załadowaniem próbki.
AC, DS, IEX i SEC zostały wykonane na ÄKTAxpress przy użyciu kolumn wskazanych na rysunku. Czystość każdej próbki analizowano za pomocą SDS-PAGE (barwienie Coomassie). Zredukowane próbki nałożono na żel SDS-poliakryloamidowy. Na każdy pas załadowano około 7,5 µg białka.1
Rysunek 3.53.(A) Czteroetapowy protokół oczyszczania białka znakowanego (histydyną)6 rozszczepionego proteazą AcTEV. (B) Analiza SDS-PAGE. Żel został wybarwiony Coomassie.
Referencje
Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.
Nie masz konta użytkownika?