Protokół badania przepuszczalności in vitro z użyciem membran Strat-M^®

Większość środków farmaceutycznych i kosmetycznych dostępnych obecnie na rynku jest dostarczana przezskórnie lub miejscowo drogą biernej dyfuzji. Membrany Strat-M^® zostały opracowane w celu naśladowania tego pasywnego procesu dyfuzji. Ta syntetyczna membrana została zaprojektowana w celu zapewnienia modelu niezwierzęcego do przezskórnej dyfuzji i testowania bezpieczeństwa substancji czynnych kosmetyków, preparatów, produktów higieny osobistej, aktywnych składników farmaceutycznych (API) oraz pestycydów i chemikaliów. Opracowaliśmy protokół testowania dyfuzji preparatów kofeiny przy użyciu membran Strat-M^®. Protokół ten może być wykorzystany jako podstawa do testowania dyfuzji innych związków przy użyciu membran Strat-M^®.

Testowanie dyfuzji przezskórnej preparatów zawierających kofeinę

Procedura

1. Konfiguracja początkowa

1. Włącz łaźnie z cyrkulującą wodą.
2. Filtruj próżniowo 500 ml buforu PBS przez filtrację próżniową i utrzymuj pod próżnią przez co najmniej 30 minut.
3. Odczekaj 30 minut, aż łaźnie wodne osiągną temperaturę (37 °C).
4. Upewnij się, że mieszanie jest włączone dla obu stref w urządzeniu Logan, włączając przełącznik mieszania z przodu urządzenia Logan.
5. Umieść 25 mm membranę Strat-M^® między komorą dawcy i komorą odbiorcy i zaciśnij je razem.
6. Upewnij się, że błyszcząca strona (skóra) membrany jest skierowana w stronę komory dawcy (góra).
7. Napełnij komorę receptora PBS, przelewając przez boczne rurki, aby upewnić się, że nie ma pęcherzyków powietrza. Platformę komory receptora można przechylić, aby upewnić się, że w komorze nie ma pęcherzyków powietrza.
8. Podłącz strzykawki 5 ml wypełnione PBS do portów pobierania próbek. W przypadku konkretnej komory receptora ta sama strzykawka o pojemności 5 ml jest używana podczas całego eksperymentu.
9. Odczekaj co najmniej 30 minut, aż PBS w komorze receptora osiągnie temperaturę 37°C.
10. Upewnij się, że podczas oczekiwania na osiągnięcie temperatury 37°C nie powstają pęcherzyki powietrza. Dodaj bufor w razie potrzeby, jeśli pojawią się pęcherzyki powietrza.
11. Dodaj 500 µL preparatu do komory dawcy za pomocą pipetora lub odpowiedniego urządzenia. Zanotuj czas.

2. Przygotowanie preparatów

Roztwór kofeiny w glikolu propylenowym + kwas oleinowy

1. Najpierw przygotuj nasycony roztwór kofeiny w glikolu propylenowym, odważając 3 ± 0,1 g kofeiny do szklanej butelki o pojemności 200 ml. Dodać 150 ± 1 ml glikolu propylenowego (PG). Zakorkować butelkę i umieścić na młynku rolkowym na co najmniej 48 godzin w temperaturze pokojowej (19 - 25 °C).
2. Filtrować roztwór kofeiny w glikolu propylenowym przy użyciu bibuły filtracyjnej Whatman^® nr 1 i zespołu filtracji próżniowej.
3. Aby przygotować roztwór kofeiny w glikolu propylenowym + kwas oleinowy (OA), zmieszaj 95 ± 0,4 ml roztworu kofeiny w glikolu propylenowym z 5 ± 0.1 ml kwasu oleinowego w szklanej butelce o pojemności 200 ml i zakrętce.
4. Opisz butelkę z roztworem kofeiny datą przygotowania, nazwą operatora i datą.
5. Przechowywanie roztworu dawcy: 90 dni od daty przygotowania w temperaturze pokojowej (19-25 °C).

Roztwór receptora (sól fizjologiczna buforowana fosforanem, pH 7,4)

1. Rozpuścić 1 opakowanie soli PBS do 1000 ml przy użyciu wody Milli-Q^® . Do przygotowania tego roztworu używa się 1000 ml certyfikowanej kolby miarowej klasy A.
2. Opisz roztwór buforowy datą przygotowania, nazwą operatora i datą.
3. Przechowywanie roztworu buforowego: 7 dni od daty przygotowania w temperaturze pokojowej (19-25 °C)
4. Objętość roztworu receptora: 5,0 mL
5. Temperatura roztworu receptora: 37 °C ± 0,5 °C
6. Mieszanie: Stałe (300 obr./min ustawione fabrycznie)
7. Czas pobierania próbek: 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 24, 26 godzin

3. Protokół pobierania próbek

1. Przed pobraniem każdej próbki sprawdź, czy nie tworzą się pęcherzyki powietrza.
2. W każdym punkcie czasowym pobierania próbki, usuń strzykawkę o pojemności 5 ml przymocowaną do indywidualnej komory i zastąp ją strzykawką o pojemności 3 ml.
3. Pobierz 1,0 ± 0.1 ml próbki z komory receptora i wyrzucić.
4. Podłącz strzykawki 3 ml do portu próbkowania i pobierz 500 ± 100 µL próbki do analizy. Ta sama strzykawka o pojemności 3 ml jest używana do pobierania próbek z pojedynczej komórki przez cały czas trwania eksperymentu.
5. Dodaj próbkę do płytki z głębokimi dołkami przy użyciu wstępnie zdefiniowanego układu.
6. Po pobraniu próbki oryginalne strzykawki o pojemności 5 ml są ponownie podłączane do odpowiednich portów, a roztwór receptora jest dodawany z powrotem do komory receptora, upewniając się, że nie pozostały żadne pęcherzyki powietrza. Tę operację można wykonać, przechylając zestaw komórek Franza, aby zapewnić całkowite usunięcie pęcherzyków powietrza.

 

Mapa płyt

* Próbka ślepa: Sól fizjologiczna buforowana fosforanami, pH 7,4 (PBS)

		1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
	Czas próby (godz.)	0	1	2	3	4	5	6	8	10	24	26	Puste*
	Komórka #
A	1	S0	S1	S2	S3	S4	S5	S6	S8	S10	S24	S26	BL
B	2	S0	S1	S2	S3	S4	S5	S6	S8	S10	S24	S26	BL
C	3	S0	S1	S2	S3	S4	S5	S6	S8	S10	S24	S26	BL
D	4	S0	S1	S2	S3	S4	S5	S6	S8	S10	S24	S26	BL
E	5	S0	S1	S2	S3	S4	S5	S6	S8	S10	S24	S26	BL
F	6	S0	S1	S2	S3	S4	S5	S6	S8	S10	S24	S26	BL
G	Standard, µg / ml	0.5	2,5	5,0	25,0	50.0	250						BL
H	Blank	BL	BL	BL	BL	BL	BL	BL	BL	BL	BL	BL	BL

4. Przygotowanie roztworu kofeiny do HPLC (krzywa kalibracyjna)

1. Odważyć 50 ± 1 mg kofeiny za pomocą wagi analitycznej i przenieść do szklanej fiolki.
2. Odnotować rzeczywistą masę kofeiny w zapisie partii.
3. Dodaj 10 ml metanolu, aby sporządzić roztwór podstawowy kofeiny.
4. Aktualne stężenie roztworu podstawowego kofeiny [µg/mL = rzeczywista masa kofeiny (µg)
5. Aktualna objętość metanolu (mL)]
6. Opisz butelkę datą przygotowania, nazwą operatora i datą.
7. Ten roztwór podstawowy może być przechowywany w temperaturze 4 °C w lodówce przez 7 dni.
8. Rozcieńczyć roztwór podstawowy zgodnie z poniższym protokołem przy użyciu buforu PBS w celu przygotowania różnych wzorców roztworu kofeiny.
9. Na podstawie rzeczywistej masy zważonej kofeiny obliczane jest rzeczywiste stężenie wzorców i zapisywane w rejestrze partii. Po przygotowaniu wzorców, następujące wzorce są używane do generowania krzywej kalibracyjnej.

*Rzeczywiste stężenie kofeiny zależy od masy kofeiny rozpuszczonej w metanolu.
Stężenie kofeiny w roztworze 1 (µg/mL) = Stężenie podstawowego roztworu kofeiny / 2
Stężenie kofeiny w roztworze 2 (µg/mL) = Stężenie podstawowego roztworu kofeiny / 10
Stężenie kofeiny w roztworze 3 (µg/ml) = Stężenie roztworu kofeiny 1 / 10
Stężenie kofeiny w roztworze 4 (µg/ml) = Stężenie roztworu kofeiny 2 / 10
Stężenie kofeiny w roztworze 5 (µg/mL) = Stężenie roztworu kofeiny 3 / 10
Stężenie kofeiny w roztworze 6 (µg/mL) = Stężenie roztworu kofeiny 4 / 10
Stężenie kofeiny w roztworze 7 (µg/mL) = Stężenie roztworu kofeiny 5 / 10
Stężenie kofeiny w roztworze 8 (µg/mL) = Stężenie roztworu kofeiny 6 / 10

Końcowe stężenie kofeiny, µg/ml		Liczba roztworu	Roztwór kofeiny (objętość)	Bufor PBS	Używany do kalibracji
Określony	Aktualna
2500 µg/mL	*	1	0.5 mL (roztwór podstawowy)	0.5 mL	Nie
500 µg/mL	*	2	0.1 mL (roztwór podstawowy)	0.9 mL	Nie
250 µg/mL	*	3	0.1 mL (Roztwór 1)	0.9 mL	Tak
50 µg/mL	*	4	0.1 mL (Roztwór 2)	0.9 mL	Tak
25 µg/mL	*	5	0.1 mL (Roztwór 3)	0.9 mL	Tak
5 µg/mL	*	6	0.1 mL (Roztwór 4)	0,9 mL	Tak
2.5 µg/ml	*	7	0.1 mL (Roztwór 5)	0.9 mL	Tak
0.5 µg/ml	*	8	0.1 mL (Roztwór 6)	0,9 mL	Tak

5. Analiza próbek metodą HPLC

*ACN = acetonitryl

Chemical	Używana kolumna	Faza mobilna	Szybkość przepływu	Długość fali detekcji	Objętość iniekcji
Kofeina	Agilent Eclipse XDB, 4.6 mm X 150 mm, 5 µm (# 993967-902)	Woda z 0,1% kwasem mrówkowym + ACN* z 0.1% kwasu mrówkowego (80:20 v/v)	1 mL/min	272 nm	10 µL

Sprzęt i materiały eksploatacyjne

Produkt	Sprzedawca	Numer części
Instrument komórkowy Franz (Logan)	Logan	Model FDC-6T
Regulator temperatury	Logan	VTC-200
Różne zlewki do transferu chemikaliów	Fisher Scientific lub równoważne	Klasa A
Różne cylindry miarowe do transferu chemikaliów	Fisher Scientific lub równoważne<	Klasa A
Różne kolby miarowe do przygotowywania buforów/roztworów	Fisher Scientific lub równoważne	Klasa A
Waga laboratoryjna	Mettler Toledo®	Model PG5002-S lub równoważny
Plastikowe jednorazowe pipety transferowe	Fisher Scientific lub równoważne	Klasa A
Pipetor cyfrowy (100 - 1000 µl)	Gilson lub równoważny	H8315780 lub równoważny
Pipetor cyfrowy (20 - 200 µl)	Eppendorf® lub równoważny	3530085 lub równoważny
Bibuła filtracyjna (# 1)	Whatman®	1001-042 lub odpowiednik
Strzykawki - 3 mL	Fisher Scientific	14-823-435 lub równoważny
Strzykawki - 5 mL	Fisher Scientific<	S30467-6 lub równoważny
Stericup® sterylna jednostka filtrująca z membraną PVDF 0.2 µm PVDF	Millipore®	SCGVU05RE
Płytka 96-dołkowa Deep Well	Fisher Scientific lub równoważny	12565606 lub równoważny