Oznaczanie WWA w papryce w proszku przy użyciu SPE

Katherine K. Stenerson

Principal R&D Scientist

Artykuł z Analytix Reporter - Wydanie 2

Wprowadzenie

Papryka jest przyprawą wytwarzaną z suszonej słodkiej papryki i jest używana do nadawania smaku i koloru w wielu rodzajach kuchni. Zanieczyszczenie wielopierścieniowymi węglowodorami aromatycznymi (WWA) może wystąpić, gdy rośliny papryki są narażone na te zanieczyszczenia w środowisku i/lub podczas procesu suszenia. Stosowanie ziół w gotowaniu i produkcji żywności staje się coraz bardziej popularne, dlatego narażenie na WWA, szczególnie te o właściwościach rakotwórczych, jest niepokojące. Unia Europejska (UE) posunęła się tak daleko, że uregulowała najwyższe dopuszczalne poziomy kilku WWA w suszonych ziołach i przyprawach.

W szczególności dla papryki, najwyższe dopuszczalne poziomy zostały ustalone na 10 ng/g dla benzo[a]pirenu i 50 ng/g łącznie dla sumy benzo[a]pirenu, chryzenu, benzo[a]antracenu i benzo[b]fluorantenu.¹

Metody przygotowania próbek stosowane w badaniach WWA w ziołach i przyprawach wymagają ekstrakcji rozpuszczalnikiem, a następnie etapu oczyszczania. Stosowane metody oczyszczania obejmują chromatografię żelowo-permeacyjną (GPC) i ekstrakcję do fazy stałej (SPE) za pomocą żelu krzemionkowego. ^2,3 W ciągu ostatnich kilku lat nowe podejście do oczyszczania próbek o wysokim tle do analizy pod kątem WWA wykorzystywało dwuwarstwowy wkład SPE zawierający górną warstwę Florisil^® i dolną warstwę Z-Sep/C18. Ten wkład, Supelclean™ EZ-POP NP, został użyty do bezpośredniej ekstrakcji WWA z olejów jadalnych i do oczyszczania ekstraktów próbek fauny i flory.^4,5 W tej pracy analizowano WWA z próbek papryki przy użyciu zoptymalizowanej ekstrakcji QuEChERS, a następnie oczyszczania za pomocą wkładu SPE EZ-POP NP. W porównaniu do oczyszczania QuEChERS za pomocą luźnych sorbentów, EZ-POP NP dał znacznie czystszy ekstrakt. Optymalizacja procedur ekstrakcji i oczyszczania EZ-POP NP zaowocowała odzyskiem na poziomie >70% przy poziomie spikowania 10 ng/g; obliczonym bez korekty standardu wewnętrznego.

Eksperyment

Próbki papryki uzyskano w lokalnym sklepie spożywczym. Próbki do oceny dokładności i odtwarzalności metody zostały wzbogacone w ilości 10 ng/g mieszaniną zawierającą WWA wymienione w Tabeli 1. Po naniesieniu próbki pozostawiono do wyrównania przez 1 godzinę przed ekstrakcją. Ekstrakty próbek przygotowano przy użyciu procedury opisanej na Rysunku 1. Ekstrakty poddano następnie oczyszczaniu SPE przy użyciu wkładu EZ-POP NP, jak opisano szczegółowo na Rysunku 2. Analizę przeprowadzono metodą GC/MS/MS z zastosowaniem warunków przedstawionych w Tabeli 2 i przejść w Tabeli 1. Wewnętrzna mieszanina wzorcowa została dodana do ekstraktów tuż przed analizą GC i była używana tylko do monitorowania wydajności urządzenia. Próbki oznaczono ilościowo względem dopasowanej do matrycy krzywej kalibracyjnej przygotowanej w ekstrakcie z papryki bez domieszek.

Tabela 1 Analizowane WWA i przejścia wykorzystywane do analizy GC/MS/MS

Peak No.	Compound	RT	MRM 1	CE	MRM 2	CE
1	Naphthalene-d8 (IS)	5.21	136/108	20	136/84	25
2	Naftalen	5.25	128/102	20	128/78	20
3	Acenaftylen	7.62	152/126	30	152/102	30
4	Acenafen	7.88	153/127	30	152/126	30
5	Fluorene	9.2	166/165	15	165/164	20
6	fenantren	13.5	178/152	25	176/150	25
7	Antracen	13.71	178/151	30	176/150	25
8	Fluoranten-d10 (IS)	20.76	212/208	35	210/208	15
9	Fluoranten	20.91	202/152	30	201/200	15
10	Piren	22.95	201/200	15	200/174	25
11	Benz[a]antracen	29.42	228/226	30	114/101	10
12	Cyklopenta[cd]piren	29.72	226/225	30	226/224	40
13	Chryzen	29.81	228/226	30	113/112	10
14	5-metylochryzen (IS)	31.7	242/241	20	241/239	30
15	Benzo[b]fluoranten	33.60	252/250	30	126/113	10
16	Benzo[k]fluoranten	33.67	252/250	30	126/113	10
17	Benzo[j]fluoranten	33.71	252/250	30	126/113	10
18	Benzo[a]piren	34.64	252/250	35	125/124	10
19	Perylene-d12	34.84	264/260	35	130/116	15
20	Dibenz[a,h]antracen	37.13	278/276	35	125/124	10
21	Indeno[1,2,3-cd]piren	37.2	138/137	10	137/136	15
22	Benzo[g,h,i]perylen	38.13	138/137	15	137/136	15
23	Dibenzo[a,l]piren	41.77	302/301	20	302/300	40
24	Dibenzo[a,e]piren	43.27	302/301	40	302/300	40
25	Koronen (IS)	43.76	300/299	35	300/298	50
26	Dibenzo[a,i]piren	44.29	302/301	40	302/300	40
27	Dibenzo[a,h]piren	44.68	302/301	20	302/300	40

Wyniki i dyskusja

Warunki GC/MS/MS. Warunki analizy zostały zoptymalizowane pod kątem WWA. Wyższe temperatury portu wtrysku i MS, wraz z  ciśnieniem  pulsacyjnym  wtryskiem i wkładką wlotową o średnicy 2 mm,  zostały użyte w celu poprawy    odpowiedzi i kształtu piku. Program temperatury pieca był oparty na programie stosowanym przez Anderson i in. i był niezbędny do zapewnienia rozdzielczości chromatograficznej izomerów, takich jak benzo[b], [k] i [j] fluoranten, których nie można rozróżnić na podstawie ich przejść MRM.6 Ten program temperatury, w połączeniu z kolumną kapilarną GC (SLB®-PAHms), zapewnił odpowiednią rozdzielczość wszystkich zestawów izomerycznych. Przykład tego pokazano na Rysunku 3 dla izomerów benzo [b], [k] i [j] fluorantenu. Izomerów tych nie można rozdzielić na 5% fenylometylosilikonie lub fazie typu "X-5".

Rysunek 1. Procedura ekstrakcji próbki użyta dla WWA z papryki.

Rysunek 2. Procedura oczyszczania przy użyciu EZ-POP NP SPE dla ekstraktu z papryki.

Rysunek 3. Analiza GC/MS/MS benzo[b], [k] i [j] fluorantenów na kolumnach SLB®-PAH MS; 10 ppb w ekstrakcie z papryki.

Rysunek 4. Wpływ rozpuszczalnika ekstrakcyjnego na odzyskiwanie 5 i 6 pierścieniowych WWA z papryki (10 ng/g).

Tabela 2 Warunki analizy GC

column	SLB ®-PAHms, 30 m x 0,25 mm wewn, 0.25 µm (28340-U)
piekarnik	60 °C (1 min), 40 °C/min do 180 °C, 3 °C/min do 230 °C, 1.5 °C/min do 235 °C (10 min), 15 °C/min do 280 °C (3 min), 15 °C/min do 350 °C (15 min)
inj. temp	300 °C
gaz nośny	hel, 0.8 mL/min, stała
detektor	MRM, zgodnie z Tabelą 1
temperatura źródła MS.	250 °C
temperatura kwadrupolu	200 °C (Q1 & Q2)
wtrysk	1 µL, pulsacyjny splitless (60 psi do 0.75 min, rozdzielacz włączony po 0,75 min)

Optymalizacja procedury przygotowania próbek

Ekstrakcję próbek przeprowadzono w oparciu o podejście "podobne do QuEChERS". Skład rozpuszczalnika ekstrakcyjnego został zoptymalizowany ze 100% acetonitrylu zwykle stosowanego  dla QuEChERS w celu zwiększenia odzysku cięższych WWA.

Rysunek 4 przedstawia porównanie bezwzględnej odpowiedzi dla cięższych 5 & 6 pierścieniowych WWA uzyskanych z papryki z domieszką 10 ng/g i ekstrahowanych 100% acetonitrylem i mieszaniną 90:10 acetonitryl:chlorek metylenu. Uzyskane ekstrakty analizowano przed oczyszczeniem SPE w celu oceny wpływu tylko rozpuszczalnika ekstrakcyjnego.

Pierścieniowe WWA 5 i 6 wykazały lepszy odzysk przy użyciu mieszaniny 90:10, na co wskazują wyższe odpowiedzi. Zgodnie z oczekiwaniami, ekstrakt wytworzony przy użyciu mieszaniny 90:10 wykazywał więcej tła, widocznego jako oleista pozostałość. Z tego powodu nie oceniano wyższego procentu chlorku metylenu w rozpuszczalniku ekstrakcyjnym.

W przypadku oczyszczania, wkład EZ-POP NP SPE zapewniał lepsze oczyszczanie niż QuEChERS. Wkład EZ-POP NP został pierwotnie opracowany do analizy WWA z olejów jadalnych, w szczególności oliwy z oliwek. Acetonitryl jest rozpuszczalnikiem elucyjnym zalecanym do stosowania z próbkami olejów jadalnych, ponieważ zapewnia równowagę między odzyskiem analitu a retencją tła. Poprzednie prace wykazały, że dodanie chlorku metylenu zwiększyło odzysk WWA, ale miało niepożądany efekt uboczny w postaci zwiększenia ilości tła w końcowym ekstrakcie.⁴ Jednakże, ponieważ ekstrakty rozpuszczalnikowe papryki zawierały znacznie mniej oleju, możliwe było zmodyfikowanie procedury oczyszczania w celu zwiększenia odzysku 5 i 6 pierścieni  WWA bez zwiększania tła do niedopuszczalnego poziomu. W szczególności skład rozpuszczalnika elucyjnego został zmieniony tak, aby zawierał chlorek metylenu. Rysunek 5 pokazuje porównanie bezwzględnej odpowiedzi uzyskanej dla 4-6 pierścieniowych WWA  przy użyciu  różnych  elucyjnych  rozpuszczalników  podczas oczyszczania EZ-POP NP. Przetwarzane próbki to papryka (poziom 10 ng/g) ekstrahowana przy użyciu stosunku 90:10 acetonitryl:chlorek metylenu. Odpowiedzi wszystkich WWA wzrosły wraz z dodaniem chlorku metylenu do rozpuszczalnika elucyjnego. Różnica w odpowiedziach między 10 a 20% dodatkiem była minimalna dla niektórych związków; jednak tło w końcowym ekstrakcie wzrosło. W związku z tym jako rozpuszczalnik do elucji w procesie oczyszczania EZ-POP NP wybrano stosunek 90:10 acetonitryl:chlorek metylenu.

Rysunek 5. Wpływ składu rozpuszczalnika elucyjnego stosowanego podczas oczyszczania EZ-POP NP na odzyskiwanie 4-6 pierścieniowych WWA z domieszkowanej papryki (10 ng/g).

Rysunek 6. Ekstrakty papryki oczyszczone przy użyciu EZ-POP NP SPE i QuEChERS z podobnymi sorbentami. Z-Sep, Z-Sep/C18 i Z-Sep+ są oczyszczane metodą QuEChERS

Rysunek 7. Porównanie skanowania GC/MS ekstraktów papryki; EZ-POP NP, QuEChERS z Z-Sep+ i bez oczyszczania.

Rysunek 8. Analiza GC/MS/MS WWA w papryce, z domieszką 10 ng/g, po oczyszczeniu za pomocą EZ-POP NP. Identyfikatory pików są zgodne z Tabelą 1.

Redukcja tła

W przypadku suchych próbek, takich jak papryka, oczyszczanie QuEChERS przy użyciu luźnych sorbentów nie zapewnia wystarczającej pojemności do redukcji tła do akceptowalnego poziomu. Jeśli analiza dotyczy pestycydów, do oczyszczania można użyć dwuwarstwowych wkładów SPE zawierających węgiel i pierwszorzędową aminę drugorzędową (PSA) lub krzemionkę funkcjonalizowaną aminopropylem. Jednak w przypadku WWA węgiel nie może być stosowany, ponieważ silnie zatrzymuje te związki, co skutkuje słabym odzyskiem. EZ-POP NP nie zawiera węgla, a zatem jest odpowiedni dla WWA. Jego zdolność oczyszczania została porównana bezpośrednio z QuEChERS przy użyciu mieszanek zawierających sorbenty podobne do tych we wkładzie EZ-POP NP. Ekstrakty papryki wygenerowane przy użyciu 90:10 acetonitryl:chlorek metylenu i oczyszczone przy użyciu EZ-POP NP i QuEChERS pokazano na Rysunku 6. W porównaniu do braku oczyszczania, oba podejścia zmniejszyły kolor, przy czym EZ-POP NP miał najjaśniejszy kolor. Próbka oczyszczona za pomocą Z-Sep wykazała pewne oleiste pozostałości, widoczne po wewnętrznej stronie fiolki. Używając skanu GC/MS do porównania (Rysunek 7), czyszczenie EZ-POP NP dało najniższe tło, szczególnie w odniesieniu do usuwania kwasów tłuszczowych C16 i C18. Przedstawiono tu tylko dane Z-Sep+, ponieważ miał on najniższe tło z trzech sorbentów QuEChERS uwzględnionych w porównaniu. Stosując ostateczną, zoptymalizowaną metodę oczyszczania z EZ-POP NP, wszystkie WWA zostały wykryte bez tła, jak pokazano na Rysunku 8.

Odzysk i analiza próbek nieznanych

Dane dotyczące odzysku i odtwarzalności dla analiz próbek papryki z domieszką 10 ng/g przedstawiono w Tabeli 3. Wszystkie wartości odzysku zostały określone bez korekty standardu wewnętrznego, a zatem są bezwzględne. Ogólnie rzecz biorąc, odzyski były bardzo dobre (70%) z wartościami RSD <15%. Wyjątkami były fluoren i dibenzo[a,h]piren. Wystąpiły pewne zakłócenia matrycy eluujące z pikiem fluorenu (obecne w obu monitorowanych MRM), a dla dibenzo[a,h]pirenu odpowiedź była nieregularna ze skoków, co skutkowało słabą odtwarzalnością.

Tabela 3 Odzysk i odtwarzalność dla WWA z papryki, poziom próbkowania 10 ng/g (n = 3)

n=3	avg. % odzysku	% RSD
Naftalen	124%	11%
Acenaftylen	78%	13%
Acenaftylen	76%	15%
Fluoren	52%	27%
Fenantren	102%	4%
Antracen	78%	12%
Fluoranten	95%	7%
Piren	100%	3%
Benz[a]antracen	99%	9%
Cyklopenta[c,d]piren	70%	12%
Chryzen	99%	6%
5-Metylochryzen	91%	10%
Benzo[b]fluoranten	89%	6%
Benzo[k]fluoranten	82%	6%
Benzo[j]fluoranten	97%	8%
Benzo[a]piren	91%	12%
Dibenz[a,h]antracen	84%	6%
Indeno[1,2,3-cd]piren	86%	12%
Benzo[g,h,i]perylen	80%	5%
Dibenzo[a,l]piren	108%	12%
Dibenzo[a,e]piren	82%	5%
Dibenzo[a,i]piren	108%	15%
Dibenzo[a,h]piren	147%	36%

Oprócz papryki użytej do odzyskania kolców, przeanalizowano jeszcze dwie marki bez kolców. Jedna z nich została oznaczona jako "papryka wędzona", a zatem spodziewano się, że będzie zawierać znacznie wyższe poziomy WWA. Obie marki zostały przeanalizowane w dwóch egzemplarzach, a wyniki podsumowano w Tabeli 4. W marce A wykryto kilka WWA, ale żaden z nich nie przekraczał limitów UE dla ziół i przypraw. Z drugiej strony, wędzona próbka zawierała wykrywalne poziomy wszystkich czterech WWA wymienionych w rozporządzeniu UE. Benzo[a]piren był obecny poniżej maksymalnego dopuszczalnego poziomu 10 ng/g; jednak połączone poziomy tego WWA oraz benzo[a]antracenu, chryzenu i benzo[b]fluorantenu były znacznie powyżej maksymalnego poziomu 50 ng/g. Można się tego spodziewać, ponieważ proces wędzenia wytwarza WWA, które następnie trafiają do papryki. Jednak rozporządzenie UE wyraźnie stanowi, że ponieważ wędzone zioła są zwykle spożywane w tak małych ilościach, są one wyłączone z tych limitów regulacyjnych.

Tabela 4 Analiza papryki w niedomieszkowanych próbkach (% RPD = % odtwarzalności)

	Marka A		Marka B*
n=2	Conc. (ng/g)	%RPD	Conc. (ng/g)	%RPD
Naftalen	69.8	5%	302	3%
Acenafen	3.0	10%	211.6	1%
Acenaftylen	ND		27.7	4%
Fluorene	ND		272.2	6%
Fenantren	25.1	2%	2833	56%
Antracen	ND		677	4%
Fluoranten	ND		995	8%
Piren	ND		884	7%
Benz[a]antracen	ND		177.6	7%
Cyklopenta[c,d]piren	7.1	1%	99	7%
Chryzen	ND		103.1	8%
5-Metylo-chryzen	ND		0.6	25%
Benzo[b]fluoranten	ND		10.8	5%
Benzo[k]fluoranten	ND		ND
Benzo[j]fluoranten	ND		6.4	5%
Benzo[a]piren	ND		8.3	6%
Dibenz[a,h]antracen	ND		ND
Indeno[1,2,3-cd]piren	ND		2.3	2%
Benzo[g,h,i]perylen	ND		2.6	5%
Dibenzo[a,l]piren	ND		ND	.
Dibenzo[a,e]piren	ND		ND
Dibenzo[a,i]piren	ND		ND
Dibenzo[a,h]piren	ND		ND

*papryka wędzona

 

Cięższe WWA mogą być trudne do analizy na niskich poziomach za pomocą GC/MS ze względu na problemy z odpowiedzią i kształtem piku. Wydajność urządzenia może gwałtownie spaść po wstrzyknięciu zanieczyszczonych próbek. Aby ustalić, czy miało to miejsce w przypadku analizy ekstraktów z papryki, przed analizą do ekstraktów dodano wewnętrzne wzorce niecelowych WWA z 4-6 pierścieni. Reakcja tych związków była następnie monitorowana przez cały czas trwania analizy. Nie zaobserwowano spadku odpowiedzi dla żadnego z wzorców wewnętrznych, a zmienność zliczeń powierzchni w całym przebiegu wynosiła <15% dla każdego z nich.

Wnioski

Opracowano metodę przygotowania próbek do analizy niskiego poziomu WWA w proszku paprykowym. Protokół ekstrakcji wykorzystywał "zmodyfikowane podejście QuEChERS", w którym do rozpuszczalnika ekstrakcyjnego dodano chlorek metylenu w celu zwiększenia odzysku. Oczyszczanie uzyskano przy użyciu SPE z wkładem EZ-POP NP z dodatkiem chlorku metylenu do rozpuszczalnika elucyjnego acetonitrylu. Modyfikacja ta zaowocowała bezwzględnym odzyskiem 4-6 pierścieniowych WWA na poziomie 80% z wartościami RSD < 15% dla większości. Oczyszczanie SPE znacznie zmniejszyło tło w ekstrakcie, zwłaszcza dla kwasów tłuszczowych C16 i C18, w porównaniu do oczyszczania QuEChERS przy użyciu luźnych sorbentów. Analiza WWA na kolumnie GC specyficznej dla danego zastosowania (SLB^®-PAHms) była konieczna do chromatograficznego rozdzielenia zestawów izomerycznych, których nie można rozróżnić na podstawie MRM.

Aby zapoznać się z pełną gamą naszych wzorców WWA, odwiedź SigmaAldrich.com/pahstandards

Referencje

1. Commission Regulation (EU) 2015/1933 of 27 October 2015 amending Regulation EC/1881/2006 as regards maximum levels for polycyclic aromatic hydrocarbons in cocoa fibre, banana chips, food supplements, dried herbs and dried spices. Off. J. Eur. Union 2015, L282/11..

2. Rozentale I, Yan Lun A, Zacs D, Bartkevics V. 2018. The occurrence of polycyclic aromatic hydrocarbons in dried herbs and spices. Food Control. 8345-53. https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2017.04.018

3. Monago-Maraña O, Pérez RL, Escandar GM, Muñoz de la Peña A, Galeano-Díaz T. 2016. Combination of Liquid Chromatography with Multivariate Curve Resolution-Alternating Least-Squares (MCR-ALS) in the Quantitation of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons Present in Paprika Samples. J. Agric. Food Chem.. 64(43):8254-8262. https://doi.org/10.1021/acs.jafc.6b03852

4. Stenerson KK, Shimelis O, Halpenny MR, Espenschied K, Ye MM. 2015. Analysis of Polynuclear Aromatic Hydrocarbons in Olive Oil after Solid-Phase Extraction Using a Dual-Layer Sorbent Cartridge Followed by High-Performance Liquid Chromatography with Fluorescence Detection. J. Agric. Food Chem.. 63(20):4933-4939. https://doi.org/10.1021/jf506299f

5. Cabillic, J.; Fallot, C.,Final Report on the Feasibility Study of QuEChERS Extraction and / or Purification for Analysis of PAHs in Biota, AQUAREF Report 2015 - 22 p..

6. Anderson KA, Szelewski MJ, Wilson G, Quimby BD, Hoffman PD. 2015. Modified ion source triple quadrupole mass spectrometer gas chromatograph for polycyclic aromatic hydrocarbon analyses. Journal of Chromatography A. 141989-98. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2015.09.054