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Glutathion-Assay-Kit

• UNSPSC-Code: 41116133
• NACRES: NA.84

Eigenschaften

• Verwendung: sufficient for 100 tests
• Qualitätsniveau: 100
• Hersteller/Markenname: Calbiochem^®
• Lagerbedingungen: do not freeze; protect from light
• assay range: sensitivity: 5.0 μM; (RSH)
• Aufnahme: sample type cell lysate; sample type cell lysate; sample type tissue homogenate(s); sample type tissue homogenate(s)
• Nachweisverfahren: colorimetric
• Versandbedingung: wet ice
• Lagertemp.: 2-8°C

Beschreibung

Allgemeine Beschreibung

Bei den meisten, wenn nicht sogar bei allen menschlichen Krankheiten kommt es zu oxidativem Stress. Unser Verständnis darüber, welche Rolle reaktive Sauerstoffspezies beim Fortschreiten pathologischer Veränderungen spielen, befindet sich noch in der Entwicklung. Bisher gab es keine zweckmäßigen, genauen und reproduzierbaren Methoden zur Messung von Parametern des oxidativen Stresses. Glutathion (γ-Glutamylcysteinylglycin bzw. GSH) ist ein natürlich vorkommendes Tripeptid, dessen nukleophile und reduzierende Eigenschaften eine zentrale Rolle in Stoffwechselwegen sowie im antioxidativen System der meisten aeroben Zellen spielen. GHS spielt eine wichtige Rolle als Coenzym für eine Vielzahl von Enzymen, darunter Glutathionperoxidase, Glutathion-S-Transferase und Thiol-Transferase. GSH spielt im Arzneimittelstoffwechsel, im Kalziumstoffwechsel, im γ-Glutamylzyklus, in den Blutplättchen und in den Membranfunktionen ebenfalls eine wichtige Rolle. Darüber hinaus ist GSH für zahlreiche Lebensprozesse von entscheidender Bedeutung, darunter die Entgiftung von Xenobiotika, die Aufrechterhaltung des -SH-Gehalts von Proteinen, der Thiol-Disulfid-Austausch, die Beseitigung von Hydroperoxiden und freien Radikalen sowie der Transport von Aminosäuren durch Membranen. Die physiologischen Werte für intrazelluläres GSH liegen im Allgemeinen zwischen 1 und 10 mM. Es wurden zwar schon viele Methoden für die Bestimmung von GSH beschrieben, die zuverlässigen Methoden sind jedoch arbeitsintensiv und nicht einfach in der Anwendung.

Ein spektrophotometrisches Testkit, das speziell für Glutathion (GSH) oder Gesamt-Mercaptane bestimmt ist. Die Absorption wird für GSH bei ~ 400 nm und für die Gesamt-Mercaptane bei ~ 356 nm gemessen.

Hinweis: 1 T = 1 Test.

Komponenten

Ein Chromogen, 30 % NaOH, Puffer und eine Anwendervorschrift.

Warnhinweis

Toxizität: Mehrere Toxizitätswerte, siehe MSDS (O)

Spezifikationen

Testzeit: 1,5 Std.

Prinzip

Mit dem Glutathion-Assay-Kit von Calbiochem^® kann Glutathion mit nur einer Probenahme und einer kolorimetrischen Messung bestimmt werden. Mit einer von dieser Methode abgewandelten Methode können auch andere Mercaptane untersucht werden. Dieses alternative Protokoll basiert auf der Messung von Substitutionsprodukten, die bei Abwesenheit von Reagenz R2 bei 356 nm eine maximale Absorption aufweisen. Aufgrund ihrer einfachen Anwendung eignet sich diese Methode gut für die Quantifizierung von Glutathion und Gesamt-Mercaptanen in einer Vielzahl von biologischen Proben. Der Hauptvorteil der Methode ist, dass sie kein Enzym als Reagenz benötigt.

Angaben zur Herstellung

Erythrozyten-Lysat

1. Mindestens 500 L Vollblut bei 2500 x g bei 4 °C 5 Minuten lang zentrifugieren.
2. Den Plasmaüberstand entsorgen. Wenn der Test nicht sofort durchgeführt wird, das Erythrozytenpellet bei -70 °C aufbewahren (das Erythrozytenpellet kann bei -70 °C 15 Tage lang gelagert werden).
3. Das Erythrozytenpellet in 4 Volumina MPA-Arbeitslösung, 0-4 °C, resuspendieren.
4. Gründlich mischen und bei 3000 x g bei 4 °C 10 Minuten lang zentrifugieren.
5. Die obere klare wässrige Schicht auffangen und für den (innerhalb von 1 Stunde stattfindenden) Test bei 0–4 °C aufbewahren.

Homogenate der Leber

1. Gewebe in 0,9%iger NaCl-Lösung waschen.
2. Gewebe auf Papier tupfen und wiegen.
3. Gewebe in eiskalter MPA-Arbeitslösung zerkleinern.
4. Das zerkleinerte Gewebe homogenisieren.
5. Homogenat bei 3000 x g bei 4 °C 10 Minuten lang zentrifugieren.
6. Die obere klare wässrige Schicht* auffangen und für den (innerhalb von 1 Stunde stattfindenden) Test bei 0–4 °C aufbewahren.
*Trüber Überstand sollte durch 0,2-m-Filter filtriert werden.

Hepatozyten-Lysate

1. Hepatozyten*-Pellet von Ratten oder Mäusen in 500 L eiskalter MPA-Arbeitslösung resuspendieren.
2. Zellsuspension homogenisieren.
3. Homogenat bei 3000 x g bei 4 °C 10 Minuten lang zentrifugieren
4. Die obere klare wässrige Schicht auffangen und für den (innerhalb von 1 Stunde stattfindenden) Test bei 0–4 °C aufbewahren.
*Es werden ca. 2,5–3,5 x 10⁶ Zellen verwendet (5–8 mg Gesamtprotein).

Lagerung und Haltbarkeit

Den gesamten Kit-Inhalt nach dem Empfang bei 4 °C lagern.

• Alle Reagenzien- und Pufferlösungen sind fest verschlossen und sind bei sachgemäßer Lagerung von bis zu 4 °C stabil. Nicht einfrieren. Vor Licht schützen.

• Nach der Entnahme der erforderlichen Menge jedes Reagenzes für den sofortigen Gebrauch sollten alle Flaschen fest verschlossen und bei 2–4 °C gelagert werden. Die Reagenzflaschen nicht offen oder bei Raumtemperatur stehen lassen.

Hinweis zur Analyse

Messung der Gesamt-Mercaptane (RSH): Assay bei 356 nm

Das Calbiochem-Glutathion-Assay-Kit kann für die Messung anderer Mercaptane (RSH), zum Beispiel GSH, verwendet werden. Der Assay wird in Abwesenheit von Reagenz R2 bei 356 nm durchgeführt. Die Absorption bei 356 nm ist eine lineare Funktion der [RSH-]Konzentration in der Probe, sie ist jedoch nicht GSH-spezifisch. Enthält die Probe im Wesentlichen GSH und ein einziges anderes Mercaptan, z. B. N-Acetylcystein, so können diese beiden Mercaptane unter Verwendung derselben Einzelprobe für zwei Messungen bestimmt werden. Die erste Messung erfolgt vor der Zugabe von Reagenz R2 bei 356 nm, wie unten beschrieben, und die zweite Messung erfolgt nach der Zugabe von R2 bei 400 nm.

Die Absorption des Spektrophotometers bei 356 nm nur mit Puffer (Lösung 3) auf Null einstellen. Das Reaktionsgemisch wird wie in Abschnitt 3 hergestellt, wobei Schritt 4 ausgelassen wird. Die Absorption (A) wird bei 356 nm gemessen.

Zur Berechnung der Konzentration muss eine Standardkurve mit dem entsprechenden Mercaptan aus Tabelle 2 erstellt werden. Abbildung 2 enthält zwei Beispiele für Standardkurven, die mit Glutathion und Nacetylcystein bei 356 nm erzielt wurden.

GSH-Konzentration
Die Kalkulation basiert auf der folgenden Gleichung:
[GSH] = {(A-A₀)/(E x l)} x D
wobei Folgendes gilt:
[GSH] ist die anfängliche Glutathionkonzentration in der Probe, ausgedrückt als molare Konzentration.

A und A₀ sind die in Anwesenheit bzw. in Abwesenheit der Probe gemessenen Absorptionen.

E ist der offensichtliche molare Absorptionskoeffizient des Produkts, gemessen bei 400 nm.

l ist der Strahlengang (cm).

D ist der Verdünnungsfaktor der Probe.

Gesamt-Mercaptankonzentration
Die Berechnung basiert auf der modifizierten Version der für GSH verwendeten Gleichung:
[Gesamt-RSH] = { (A - A₀) / (E x I) } x D
wobei Folgendes gilt:
[Gesamt-RSH] ist die Konzentration des Gesamt-Mercaptans in der Probe.

A und A₀ sind die in Anwesenheit bzw. in Abwesenheit der Probe gemessenen Absorptionen.

E ist der vermeintliche molare Absorptionskoeffizient des Produkts, gemessen bei 356 nm.
I ist der Strahlengang (cm).

D ist der Verdünnungsfaktor der Probe.

Hinweis:

• Die Reagenzien R1 und R2 nicht in umgekehrter Reihenfolge zugeben.
• Die Temperatur (25 ± 3 °C) sollte während des gesamten Versuchs konstant gehalten werden.
• Das endgültige Reaktionsvolumen (1 ml) sollte sich von einer Messung zur anderen nicht ändern.
• Die Absorption bei 400 nm ist proportional zur Glutathionkonzentration. Sie ist minutenlang stabil unter der Voraussetzung, dass das Reaktionsgemisch im Dunkeln aufbewahrt wird.
• Die Empfindlichkeit des Assays gegenüber Mercaptanen bei 356 nm liegt in der gleichen Größenordnung wie die von Glutathion bei 400 nm (siehe Tabelle 2).

Sensitivität: Aus 30 wiederholten Messungen, die an demselben Tag und unter denselben Versuchsbedingungen an der Kontrolle ([RSH] = 0) durchgeführt wurden, ergab sich im endgültigen Reaktionsgemisch (Spektralphotometer-Küvette) eine Assay-Nachweisgrenze von 5 µmol/L. Die Verwendung des maximalen Volumens von 300 µL einer Probe beispielsweise würde also eine Nachweisgrenze für Glutathion von etwa 17 µmol/L ergeben.

Sonstige Hinweise

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Ji, L.L. und Fu, R. 1992. J. Appl. Physiol.72, 549.
Anderson M.E. 1989. Enzymatische und chemische Methoden zur Bestimmung von
Glutathion; In: Glutathione: chemical, biochemical and medical aspects, Vol. A, Dolphin D., Poulson R. und Avramovic O. Eds., John Wiley and Sons, S. 339–365.
Dolphin D. et al. 1989. Glutathione: Chemical, Biochemical and Medical Aspects, Band A und B, J. Wiley and Sons.

Rechtliche Hinweise

CALBIOCHEM is a registered trademark of Merck KGaA, Darmstadt, Germany

Sicherheitshinweise

• Piktogramme: GHS05
• Signalwort: Danger
• H-Sätze: H290,H314
• P-Sätze: P234 - P280 - P303 + P361 + P353 - P304 + P340 + P310 - P305 + P351 + P338 - P363
• Gefahreneinstufungen: Eye Dam. 1 - Met. Corr. 1 - Skin Corr. 1A
• Lagerklassenschlüssel: 8B - Non-combustible corrosive hazardous materials
• Flammpunkt (°F): Not applicable
• Flammpunkt (°C): Not applicable