억제제 사용 방법

실험에 적합한 억제제를 선택하는 방법과 억제제를 사용한 실험을 성공적으로 계획하는 방법 등 억제제를 성공적으로 사용하는 방법에 대한 팁과 요령을 읽어보세요.

• 올바른 억제제를 선택하는 방법
  
  • 억제제 선택 팁
  • 억제제 선택의 예
• 억제제를 사용한 실험을 계획하는 방법
  • 분석 시 억제제를 성공적으로 사용하기 위한 팁과 요령
  • 억제제는 얼마만큼 사용해야 하나요?
• 관련 억제제 제품

올바른 억제제를 선택하는 방법

억제제를 사용하는 실험을 시작하기 전에 몇 가지 중요한 질문을 해야 합니다. 

억제제 선택 팁

올바른 억제제를 선택하기 위한 팁은 다음과 같습니다.

• 어떤 분자가 기능 장애에 중요한 영향을 미치는지 파악합니다.
  
• 특정 실험에 광범위 억제제 또는 특이적 억제제 중 무엇이 적합한지 결정합니다.
• 억제될 가능성이 있는 다른 효소와 효소가 억제되는 농도를 살펴보세요.
  • 예를 들어, H-89는 단백질 키나아제 A에 사용하기 적합한 억제제입니다(IC₅₀=48nM). 그러나 훨씬 더 높은 농도에서는 단백질 키나아제 C(IC₅₀=31.7 μM), 마이오신 경쇄 키나아제(K_i=28.3 μM), Ca²⁺/칼모듈린 의존성 단백질 키나아제 II(K_i=29.7 μM), 카제인 키나아제 I(K_i=38.3 μM) 등도 억제합니다.
• IC₅₀이 낮을수록 더 강력한 억제제입니다. 억제제의 IC₅₀ 을 확인하세요. 독성이 우려되나요?
• 세포 기반 억제제의 필요 여부를 결정하세요. 세포 투과성은 세포 기반 억제제 연구의 주요 고려 사항입니다.
• 억제제가 가역적이어야 하는지 여부를 결정하세요. 세포 투과성과 가역성에 따라 억제제 선택이 제한될 수 있습니다.
• 경쟁적, 비경쟁적 억제제 등 우려되는 작용 기전을 결정하세요. 선택한 억제제의 기전을 먼저 이해하는 것이 더 중요할 수 있습니다.
• 억제제의 순도는 얼마인가요? HPLC를 이용한 98%의 순도는 TLC를 이용한 98%의 순도보다 훨씬 우수합니다.
• 분석 시 재구성 용매를 호환하여 사용할 수 있는지 확인하세요.
  • 대부분의 세포는 최대 1%의 다이메틸 설폭사이드(DMSO)를 견딜 수 있습니다. 메탄올, 아세토나이트릴, 다이메틸폼아마이드(DMF)와 같은 용매는 세포에 독성이 있으며 세포의 생존성에 영향을 미칩니다.
• 바이알 라벨을 확인하여 빛이나 습기로부터 세포를 보호해야 하는지 확인하세요. 경우에 따라 빛이나 습기에 노출되면 분자가 손상될 수 있습니다.
• 당사의 생체 활성 저분자 검색 도구를 사용하여 억제제를 찾거나 현지 기술 서비스 과학자에게 문의하여 권장 사항을 확인하세요.

억제제 선택의 예

다음은 일반적인 여러 응용분야에서 억제제 선택과 관련된 몇 가지 예입니다. 이는 일부 예시일 뿐이며, 구체적인 실험 모델에 대해서는 기술 지원 서비스 팀에 문의하거나 적절한 문헌을 참조하시기 바랍니다.

단백질 키나아제 C 억제제 선택

• 살아있는 세포에서 세린/트레오닌 잔기에 영향을 미치는 광범위한 인산화 현상을 가역적으로 억제하기 위해, 광범위한 세포 투과성 억제제인 스타우로스포린(제품 번호 569397)을 사용할 수 있습니다. 스타우로스포린은 알려진 대부분의 세린/트레오닌 단백질 키나아제를 억제합니다.
• 살아있는 세포에서 단백질 키나아제 C의 모든 동질 효소를 억제하려면 비스인돌릴말레이미드(제품 번호 203290)와 같은 PKC 특이적 세포 투과성 억제제를 선택해야 합니다. 이는 IC₅₀ 값이 매우 낮으며(낮은 nM 범위) 모든 PKC 동질 효소를 억제합니다.
• 다음 단계에서는 살아있는 세포에서 Ca²⁺-의존성 PKC 동종형만을 억제하기 위해 Gö6976(제품 번호 365250)을 사용할 수 있습니다. 이는 PKC α, β, γ 동질 효소에 대해 매우 낮은 IC₅₀ 값(2~10nm)을 가지며 비-Ca²⁺-의존성 PKC 동질 효소에는 영향을 미치지 않습니다.

단백질분해효소 억제제 선택 기준

세포나 조직을 처리할 때는 활성 단백질분해효소가 배지에 존재하거나 분비되고 있다고 가정하는 것이 중요합니다. 따라서 시료 전처리 초기 단계에서도 단백질분해효소 억제제를 포함하는 것이 중요합니다. 최상의 결과를 얻으려면 수확 직전에 단백질분해효소 억제제를 배지에 첨가합니다. 장기간 보관한 버퍼에 억제제를 사용하는 것은 권장하지 않습니다.

세포와 조직 유형에 따라 단백질분해효소 프로필이 다르게 나타납니다.

• 세린 단백질분해효소는 모든 세포에 널리 분포되어 있음
• 박테리아 세포에는 더 높은 수준의 세린과 메탈로단백질분해효소가 포함됨
• 동물 조직 추출물은 세린, 시스테인, 메탈로단백질분해효소가 풍부함
• 식물 추출물에는 더 많은 양의 세린과 시스테인 단백질분해효소가 함유됨

시료에 존재하는 단백질분해효소의 종류가 확실하지 않은 경우 쉽게 구할 수 있는 억제제 칵테일을 사용하거나 직접 칵테일을 맞춤 설정하는 것이 좋습니다.

표 1. 단백질분해효소 억제제는 표적 유형에 따라 분류됩니다.

단백질분해효소 유형	억제제 예
아스파르틸 단백질분해효소	아세틸 펩스타틴, 펩스타틴
시스테인 단백질분해효소	안티페인, 칼파스타틴, 칼펩틴, 카텝신 억제제, 키모스타틴, 시스타틴, 류펩틴
메탈로단백질분해효소	1,10-페난쓰로린, 베스타틴, EDTA/EGTA, 포스포라미돈
세린 단백질분해효소	AEBSF, 안티키모트립신, 안티페인, 안티트롬빈, 안티트립신, 아프로티닌, 벤자미딘, 소 췌장 트립신 억제제(BPTI), DFP, 에코틴, 류펩틴, PMSF, TLCK, TPCK

카스파제 억제제가 가역적인지 비가역적인지 판별하는 방법

• C-말단기는 모든 카스파제 억제제의 가역성 또는 비가역성을 결정합니다.
• 일반적으로 알데하이드(CHO)기를 가진 카스파제 억제제는 가역적입니다.
• 클로로메틸케톤(CMK), 플루오르메틸케톤(FMK), 플루오르아크릴록시메틸케톤(FAOM)기는 반응성이 높고 효소와 공유 결합을 형성하여 비가역적 결합을 형성합니다.
  • FMK는 CMK보다 반응성이 약간 낮기 때문에 억제되는 효소 부위에 더 특이적인 것으로 간주됩니다.

FMK 기반 카스파제 억제제 사용의 장점과 CHO 기반 억제제와의 차이점

FMK 기반 카스파제 억제제

FMK 기반 카스파제 억제제는 아스파트산 또는 글루탐산의 카복실기가 에스테르화되어 세포 투과성이 있습니다. 따라서 소수성은 더 강해집니다. 이러한 억제제는 효소의 티올기를 공유 결합하여 비가역적 억제제로 만듭니다. 일반적으로 억제제의 아민 말단에는 Z기, 비오틴기, Ac기가 있습니다. 이러한 기는 또한 분자의 소수성을 증가시켜 세포 투과성을 높입니다. Ac기 또는 비오틴기가 있는 억제제에 비해 Z기가 있는 억제제는 세포 투과성이 훨씬 더 높습니다. 비오틴기가 있는 억제제는 검출 도구로 사용할 수 있으며 효소의 억제제 결합 부위를 태그하는 데 유용합니다.

CHO 기반 카스파제 억제제

CHO 기반 억제제는 FMK 기반 억제제와 다르며, 효소의 티올기가 알데하이드의 카보닐 그룹에 가역적 부가물을 형성하므로 가역적 억제제입니다. 일반적으로 CHO 기반 억제제는 수화되어 있기 때문에 결합 속도가 느립니다. 가역성의 정도는 pH, 금속 이온 농도 및 기타 조건에 따라 달라집니다. 알데하이드기가 아스파트산에 부착되면 (D-CHO) 결합물은 평형 상태에서 유사 산 알데하이드로 존재합니다. 이렇게 하면 억제제가 세포 투과성을 어느 정도 갖게 됩니다.

억제제를 사용한 실험을 계획하는 방법

효소 효율성을 정량화하기 위해 생화학자들은 일련의 실험을 수행하여 초기 반응 속도를 모니터링하고 반응의 V_max를 결정합니다.  반응 속도를 줄이고 신뢰할 수 있는 측정값을 얻으려면 가역적 또는 비가역적 억제제를 사용합니다. 다음은 생물학적 또는 생화학적 분석에 억제제를 사용할 때 따라야 할 몇 가지 권장 사항입니다.

분석 시 억제제를 성공적으로 사용하기 위한 팁과 요령

• 실험을 계획하기 전에 시료 전처리 방법(전세포, 용해물, 조직 균질액 등), 억제제 투과성, 시료의 잠재적 독성 민감도를 결정하세요.
• 억제제를 첨가하는 정확한 시기와 처리 기간은 데이터 해석에서 중요한 문제입니다.
  • 억제제는 기질 및 효소와 함께 영점 시간(time zero)에 첨가할 수 있습니다(그림 1A)
  • 또한 진행 중인 효소-기질 반응에 추가할 수도 있습니다(그림 1B)
  • 효소는 기질을 첨가하기 전 지정된 기간에 억제제와 함께 사전 배양할 수도 있습니다(그림 1C)
  • 이론적으로 효소가 완전히 억제되면 생성물이 생성되지 않아야 합니다. 이러한 반응 프로토콜은 각각 다른 결과를 제공하므로 해석도 다르게 해야 합니다. 비교를 할 때는 언제나 동일한 조건에서 데이터를 도출해야 합니다.
    • 예를 들어, 진행 중인 반응에 억제제를 추가하면(그림 1B) 반응 속도가 감소합니다. 그러나 일부 기질은 이미 최종 생성물로 변환된 후입니다. 이러한 결과는 영점 시간에 억제제를 첨가한 실험과 비교할 수 없습니다. 후자의 경우, 진행 중인 반응에 억제제를 첨가할 때보다 훨씬 적은 양의 생성물이 형성됩니다.

그림 1. 억제제 첨가 시기가 효소 활성에 미치는 영향. A. 억제제를 사용하여 사전 배양하지 않는 경우. B. 진행 중인 반응에 억제제를 추가하는 경우. C. 사전 배양에 억제제를 사용하는 경우.

• 억제제의 비특이적 효과를 보정하려면 억제제 재구성에 사용되는 용매만 추가한 대조 반응을 필수적으로 진행해야 합니다.
  • 예를 들어 억제제가 DMSO에 용해된 경우 각 실험 세트마다 DMSO 대조군 실험을 동시에 진행해야 합니다.
• 여러 시료의 실험을 진행하여 데이터를 비교하는 경우, 동일한 시점에 반응을 종료하는 것이 중요합니다.
  • 예를 들어 10개의 샘플을 동시에 실행하고 각 샘플의 배양 기간이 10분인 경우, 각 샘플이 정확히 10분 동안 억제제에 노출되도록 반응 시간을 맞추는 것이 중요합니다. 1분만 더 배양하더라도 데이터의 오류가 10% 증가할 수 있습니다. 잠복기가 짧은 경우나 반응 시간 경과를 연구할 경우에는 정확한 타이밍이 특히 중요합니다.
• 실험을 진행하는 동안, 특히 배양 기간이 긴 경우 약한 반응 버퍼의 pH가 변할 수 있습니다. 따라서 pH의 미세한 변화를 극복할 수 있는 최적의 강도를 가진 버퍼를 선택하는 것이 가장 좋습니다.
• 효소와 반응 생성물은 시간이 지남에 따라 분해될 수 있습니다. 따라서 나타나지 않은 데이터를 추정하는 것은 적절하지 않을 수 있습니다.
  • 예를 들어, 60분 후의 반응 결과는 5분 또는 10분 동안의 배양 결과를 통해 추론할 수 없습니다. 시간 경과 실험에서는 각 시점에서 병렬 실험을 진행하거나 실험을 진행한 소량의 반응 혼합물을 여러 시점에 걸쳐 피펫으로 채취하는 것이 가장 좋습니다.
• 조직 균질액 또는 세포 용해물을 대상으로 실험을 수행하는 경우 비특이적 단백질분해효소가 방출되어 효소의 일부가 파괴될 수 있습니다. 이렇게 하면 반응 초기 단계(또는 초기 시점)에서 활성 효소의 양이 이후 시점과 비교하여 더 많아져 실험 오차가 커집니다. 따라서 비특이적 단백질분해효소 활성을 피하기 위해 반응 혼합물에 적절한 단백질분해효소 억제제 칵테일을 추가하는 것이 가장 좋습니다.
  • 즉시 사용 가능한 단백질분해효소 억제제 칵테일 III(제품 번호 539134)는 포유류 세포 및 조직에 사용할 것을 적극 권장합니다.
• 특정 양의 단백질에 대한 효소 반응 결과를 표준화하려면 소량의 샘플을 단백질 분석용으로 따로 보관하는 것이 가장 좋습니다. 그런 다음, 단위 시간당 단백질 ㎎당 전환된 기질 또는 생성물을 μg 또는 ㎎으로 계산합니다.
• 반응 종료 방법을 선택할 때는 반응 생성물을 분석하는 방법에 따라 고려해야 합니다. 대부분의 경우 과염소산(PCA) 또는 트리클로로아세트산을 사용할 수 있습니다. 그러나 어떤 경우에는 이러한 산이 추가 샘플 분석에 방해가 될 수 있으므로 이러한 샘플을 중화해야 할 수도 있습니다.
  • 그러나 알칼리를 사용하여 중화하면 더 많은 염분이 생성되므로 적절한 방법을 사용하여 제거해야 합니다. 방사성 동위원소로 라벨링된 기질을 사용하여 실험을 수행할 때, '차가운(cold)' 비방사성 기질을 과도하게 첨가하면 반응이 느려져 최종 생성물에 방사능이 포함되는 것을 줄일 수 있습니다. 시료는 가능한 한 빨리 처리하거나 나중에 분석할 수 있도록 냉동(-20°C 또는 -70°C)하는 것이 가장 좋습니다.

실험용 억제제 전처리에 관한 기본 질문에 대한 답변은 당사 FAQ 문서에서 확인할 수 있습니다.

억제제는 얼마만큼 사용해야 하나요?

필요한 억제제의 양은 다음과 같은 다양한 요인에 따라 달라집니다.

• 접근성
  
• 세포 투과성
• 잠복 기간
• 사용하는 세포 유형

초기 농도를 확인하려면 관련 문헌을 찾아보는 것이 가장 좋습니다. 발표된 K_i 또는 IC₅₀ 값을 알고 있는 경우, 이 값보다 5~10배 높은 농도를 사용하여 효소 활성을 완전히 억제해야 합니다. K_i 또는 IC₅₀ 값을 알 수 없는 경우, 억제제를 다양한 농도로 시도하고 마이클리스-멘텐 반응속도론을 사용하여 K_i 값을 결정합니다. 20배 이상의 농도인 억제제를 사용하는 경우 억제 효과가 없거나 역효과가 나타나는 경우가 종종 있습니다. 억제제를 용해하는 데 사용되는 용매의 비특이적 영향을 보정하기 위해 항상 적절한 대조군 실험을 진행하세요. 

다음 실험을 시작하기 전에 알아야 할 중요 용어 및 계산에 대해 자세히 알아보세요.

연구 목적 외 사용 금지. 진단 절차에 사용 금지.