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Merck

Roche社のPCR試薬・PCRプロトコル

 

ルーチンPCR・ホットスタートPCRに用いるRoche社のPCR試薬セレクションガイド

ハイフィデリティPCR、増幅困難なテンプレートのPCR、長鎖PCRの増幅に用いるRoche社のPCR試薬セレクションガイド

*キャリーオーバー防止および6倍のフィデリティが必要ですか？Expand™ High FidelityPLUS PCR Systemを選択してください。** 20～35 kbのアンプリコンサイズにはExpand™ 20 kbPLUS PCR Systemを選択してください。

経済性を理由に最先端の科学を妥協する必要はありません。PCR技術の導入以来、Roche社はPCR試薬のゴールドスタンダードを提供してきました。私たちの高度な分離・精製・製造技術により、最も明確で信頼性の高い結果だけでなく、利便性とあらゆるラボ予算に対応できる手頃な価格を確実に実現することができます。

  • 信頼性ーロットごと、チューブごと、実験ごとに、適切な結果を得ることが可能です。
  • 性能ー利便性の高いdNTPackで優れた酵素とPCRグレードのヌクレオチドを組み合わせることで、感度と収率が向上しています。
  • 一貫性ー必要なのはプライマーとテンプレートの追加のみであるマスターミックスを用いて、実験性能を最大にしています。

PCRグレードのヌクレオチドにより最適な性能が確保されています。

PCRの成功は、酵素とヌクレオチドの選択に大きく依存します。Roche社のPCR酵素は、添加剤を含まないナトリウム塩ヌクレオチドのプレミックス溶液を含む便利なdNTPackで利用できます。これらの機能検査済みのPCRグレードヌクレオチドは、酵素合成によって製造され、独自のプロセスによって精製されたものであり、PCR結果の質に理想的に貢献します。

  • 純度ーPCRの感度を向上させるために化学的に合成されるヌクレオチドに一般的な現行の品質管理手順に従って、修飾塩基、四リン酸塩またはピロリン酸汚染物質を含まないヌクレオチドを選択しています。
  • 安定性ー至適pHで供給されるdNTPを用いて使用期限を延長し、反応の安定性を改善して収率を最大にしています。

Taq DNAポリメラーゼ・標準的なPCRプロトコル

最小限のテンプレート要件で強力な増幅を特徴とする手頃な価格のPCR。

Roche社のTaq DNAポリメラーゼはGMP条件下で製造されています。この高度に精製された酵素は、機能性と純度に関する数種類の厳格な試験に合格しており、すべてのロットで信頼性が高く一貫した結果が保証されています。詳細は、標準的なPCRプロトコルを参照してください。

  • 高いロット間一貫性をもって、信頼性が高く再現可能な結果を取得します
  • 各新規ロットのテストを不要にしますー私たちにお任せください
  • PCR交差汚染を予防するために、dUTP取込みとウラシル-DNAグリコシラーゼを併用しています
ロット間比較

図1.ロット間で一貫性があり、再現性のある結果。5ロットのTaq DNAポリメラーゼについて、λDNAの0.5 kbフラグメントの増幅能を試験した。試験したRoche社製Taq DNAポリメラーゼのすべてのロットで、信頼性が高く一貫した結果が得られている。

Taq DNAポリメラーゼ（GMPグレード）は、高性能かつバリデーション済みの増幅酵素ファミリーに属し、評価済みの製造、品質管理、充填手順を用いて製造されています。

FastStart™ Taq DNAポリメラーゼ・マスターミックス

qPCRおよびLightCycler® Systemと同様に、ポリメラーゼ研究者に信頼されるものを選択してください。

FastStart™ Taq DNAポリメラーゼは、熱に安定な化学修飾型の組換えTaq DNAポリメラーゼです。FastStart™ Taq DNAポリメラーゼは修飾されており、高温でのみ活性化されるため、アッセイの増幅が遅延する場合に理想的な酵素です。

  • より高い特異性、感度、収率が得られます。ホットスタートPCRによってPCRの性能が向上し、PCRセットアップがさらに簡単になります。
  • 便利なロボットセットアップを活用してください。完全反応ミックスは、室温で24時間安定です。
  • PCRのキャリーオーバーを防止します。dNTP取込みとウラシル-DNAグリコシラーゼと組み合わせることにより、PCRの交差汚染を防止します。
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図4.3～300 ngのcDNAから得た、即時（E0）および室温での反応セットアップの24時間後（E24）のヒトエリスロポエチン遺伝子の増幅。

FastStart™ High Fidelity PCR System

マルチプレックスやシーケンシングなどの複雑なエンドポイントPCRのアプリケーションにおいては、厳格なホットスタートとフィデリティの向上が重要です。FastStart™ High Fidelity PCR Systemを選択すると、マルチプレックスやシーケンシングに必要な、より高いフィデリティで最大5 kbの複雑なホットスタートPCRが可能になります。標準的なTaq DNAポリメラーゼおよびFastStart™ Taq DNAポリメラーゼと比較しても、精度はいずれも最大で6倍優れています。

  • 優れたマルチプレックス性能を達成し、高品質な結果が迅速に得られます
  • Taq DNAポリメラーゼやFastStart™ Taq DNAポリメラーゼと比較して、6倍のフィデリティを実現します
  • 増幅困難なテンプレートを増幅する場合は、付属のPCR添加剤（DMSO）を使用してください
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図5.18-plex （74 bp～470 bp）PCRにおける感度試験。18種類のマルチプレックスプライマーのセットをさまざまな濃度のヒトゲノムDNAに対して使用した。

Expand™ High Fidelity PCR System・Expand™ High FidelityPLUS PCR System

Expand™ High Fidelity PCR試薬は、広範なアッセイおよびアンプリコンタイプに対して協力な増幅が得られるように設計されており、Taq DNAポリメラーゼとプルーフリーディング活性を有するポリメラーゼの酵素ブレンドでロバストなPCRを実現しています。PCRキャリーオーバー防止機能を備えた最大5 kbのロバストなPCRを行うには、Expand™ High FidelityPLUSPCR Systemを選択してください。

  • すべてのアプリケーションに1つの酵素を使用できます。Expand™ High Fidelity PCR Systemは、多様なテンプレートを強力に増幅し、高い収率、フィデリティ、柔軟性を確保します。
  • 以前は検出できなかったPCR産物を検出し、偽陰性を防止します。
  • 少量のテンプレートDNAから良好な結果が得られます。

Expand™ High FidelityPLUS PCR Systemは、放射性または非放射性修飾ヌクレオチドを用いたDNAフラグメントのクローニングおよびラベリングなど、ロバストで高フィデリティなアプリケーションに理想的です。さらに、dUTP取込みにウラシル-DNAグリコシラーゼを組み合わせて、PCRの交差汚染を防止しています。

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図6.Expand™ High FidelityPlus PCR Systemと市販の4種類のポリメラーゼミックスの比較。さまざまな量（ng）のヒトゲノムDNAを用いて、組織プラスミノーゲン活性化因子（tPA）遺伝子から4.8 kbのフラグメントを各メーカーの推奨条件に従って増幅した。Expand High FidelityPLUS PCR Systemは、わずか1 ngのヒトゲノムDNAからでも、最高の特異性、感度、収率が得られる。

メーカーA：Taq DNAポリメラーゼ（N末端が欠失）、プルーフリーディングポリメラーゼ、およびホットスタート抗体の混合物。
メーカーBおよびD：Taq DNAポリメラーゼおよびプルーフリーディングポリメラーゼの混合物。
メーカーC：Taq DNAポリメラーゼ、プルーフリーディングポリメラーゼ、拡張因子の混合物。

PWO SuperYield DNAポリメラーゼ

ハイフィデリティPCRは、収率を犠牲にすることなく配列の正確性がきわめて重要であるアプリケーションで必要とされます。PWO SuperYield DNAポリメラーゼを使用すれば、一貫した高いフィデリティで高収率のPCR産物を得ることができます。Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesisキットなどに同梱されているプルーフリーディング逆転写酵素と併用する場合は、最大のフィデリティを選択し、配列エラー、塩基交換、フレームシフトを回避してください。この組み合わせは、クローニング、部位特異的変異導入、遺伝子発現解析などのアプリケーションに理想的です。

  • 優れたフィデリティと高い収率を達成します。最適化なしで、Taq DNAポリメラーゼと比較して18倍高いフィデリティ。
  • 増幅困難なテンプレートを使用して高いパフォーマンスを得ることができます。GC-RICH SolutionはGCリッチDNAの増幅を可能にします。
  • クローニングにおける作業工程を減少させます。PWO SuperYield PCRミックスで直接、酵素による消化を実施します。
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図7.RT-PCRでの精度の向上。増幅用のプルーフリーディング逆転写酵素であるTranscriptor High Fidelity Reverse Transcriptase（Roche）とプルーフリーディングポリメラーゼであるPwo SuperYield DNAポリメラーゼ（Roche）の組み合わせ。一般的に使用されているM-MuLV逆転写酵素およびTaq DNAポリメラーゼとの比較データ。454シーケンシングシステムを用いて、逆転写・25回のPCRサイクル後にエラー率を測定した。Roche社製酵素のエラー率は、少なくとも3.1×106塩基の配列を決定した、4回の独立した実験の平均値。M-MuLV逆転写酵素およびTaq DNAポリメラーゼについて、4.5×106塩基の配列を決定した。真度はエラー率 -1で表している。

増幅困難なテンプレートのPCRに用いるGC-RICH PCR System

プルーフリーディングポリメラーゼとTaq DNAポリメラーゼのブレンドであるGC-RICH PCR Systemを選択し、他のポリメラーゼまたはポリメーゼと添加剤のブレンドでは増幅が困難または不可能なテンプレートを増幅できます。このブレンドの高度な処理能力と独自のGC-RICH Resolution Solutionを組み合わせることで、優れたパフォーマンスを実現しています。

  • GCリッチな標的や反復配列などの増幅困難なテンプレートを増幅できます。
  • 同梱のPCRグレードの水、およびGC-RICH Resolution Solutionなどの最適化試薬を使用してください
  • 最大5 kbのcDNAフラグメントを転写します
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図8.GC-RICH PCR SystemによりGCリッチなテンプレートをの増幅に成功。GC-RICH PCR SystemまたはExpand High Fidelity PCR Systemを用いたヒトApoE遺伝子内の264 bpテンプレート（GC含量74%）の増幅。

結果：GC-RICH PCR Systemは、GC-RICH Resolution Solutionを用いて、GCリッチなフラグメントを高い特異性および収率で増幅しています。

Expand™ Long Range、dNTPack

ロングテンプレートPCRのパイオニアであるRoche社の次世代システムは頼りになります。ゲノムDNAから5～25kbのPCR産物を一貫して増幅できる、Expand™ Long Range dNTPackを選択してください。20 kbよりも長いフラグメントを増幅する場合には、Expand™ 20 kbPLUS PCR Systemを使用してください。この独自のシステムは、最適化された緩衝液と酵素のブレンド混合物であることを特長としています。

  • 最長25 kbの長いテンプレートを高い特異性、収率、フィデリティで一貫して増幅できます。
  • 便利で柔軟なキットにより、時間とリソースを節約できます。すべてのフラグメントサイズに対して1つの緩衝液を使用し、同梱のDMSOおよびMgCl2溶液を用いて反応を微調整できます。
  • テンプレートが長いすべてのアプリケーションに使用し、目的のフラグメントのみを高収率で得ることができます。
  • プレミックスされたPCRグレードのヌクレオチドも含まれている、費用対効果の高いdNTPackを注文してください。
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図9.Expand™ Long Range、dNTPackを用いたさまざまなゲノムテンプレートの増幅

* アンプリコンサイズが20～35 kbの場合：Expand 20 kbPLUS PCR Systemを選択してください。

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