細胞培養におけるマイコプラズマの検出と除去

• 細胞株および培養への見えない脅威
• マイコプラズマの一般的な発生源および管理方法
• マイコプラズマ検出法
• マイコプラズマ除去法
• 関連製品

細胞株および培養への見えない脅威

コンタミネーションのない培養の維持は、細胞を利用した研究の基本です。マイコプラズマは、真核細胞および幹細胞培養において最も蔓延しているコンタミネーションの一つです。マイコプラズマ属は、通常サブミクロンのサイズであり細胞壁を持たないため、顕微鏡による検出が困難または不可能であり、多くの抗生物質治療に耐性があります。

通常、マイコプラズマコンタミネーションは細胞死を起こしませんが、代謝の変化、増殖の遅延、染色体異常など培養細胞にさまざまな影響を与える可能性があります。そのような変化はすぐには気づかない場合もありますが、最終的には培養データの信頼性に影響する可能性があります。コンタミネーションされた細胞株は、機能が低下し、全く別の細胞株の挙動を示す恐れがあります。

簡単に言うと、マイコプラズマコンタミネーションによって、ライフサイエンス研究に意味のあるデータを提供する細胞株が影響を受け、その妥当性が損なわれてしまいます。

ラボにおけるマイコプラズマの一般的な発生源および管理方法

ラボでのマイコプラズマのコンタミネーション源を確実に管理することは極めて困難な課題です。ヒトの皮膚では複数種のマイコプラズマが見つかることがあり、不適切な無菌操作によって培養に持ち込まれることがあります。

これらの細菌はまた、既に混入しているウシ胎児血清などの添加物から導入される可能性もあります。また、他のコンタミネーションされた細胞培養から持ち込まれることもあります。このようなクロスコンタミネーションは、ラボにマイコプラズマが持ち込まれるよくある経路です。マイコプラズマ株は小型である（0.2～0.8 µm）ため、標準的な培地の滅菌ろ過法をすり抜けることがよくあり、培養操作中に生じたエアロゾルや微粒子によって、ラボの他のエリアにまで急速にコンタミネーションが広がる可能性があります。

マイコプラズマのコンタミネーションの管理を成功させるには、適切な無菌操作など、ラボの実施基準に厳密に従うことが重要です。また、培養におけるルーチンのマイコプラズマ試験を強く推奨します。その他のコンタミネーションの原因および予防法の詳細な情報については、細胞培養のコンタミネーションに関するトラブルシューティングをご確認ください。

実験器具や表面への除菌スプレーの噴霧やふき取りは、PCRスクリーニング結果の正確性を向上させるとともに、コンタミネーション予防の追加手段になります。

マイコプラズマ検出法

下記製品はマイコプラズマ検出のためのキットです。研究者は、マイコプラズマコンタミネーション陽性を確定するため、別のアッセイを使用したいと考える場合があります。マルチテストキットも、十分な頻度での検査により、確実に重要な培地を守ることができるキットです。よく使用されている3つのマイコプラズマ検出法は以下のとおりです。

• マイコプラズマ培養法：マイコプラズマに最適化した細菌培地に培養検査サンプルを接種し、その培地をマイコプラズマ寒天平板上で生育させます。これは、マイコプラズマコンタミネーションの直接検出法ですが、最も時間がかかる方法でもあります。培地は、評価前に少なくとも2週間インキュベートしなければならず、マイコプラズマ培養の結果が得られるまでに最長で1カ月かかる場合があります。
• DNA染色法：この簡単な方法は、HoechstまたはDAPIを用いたマイコプラズマの核の染色法による方法で、蛍光顕微鏡で可視化できます。この方法は、迅速ですが、マイコプラズマコンタミネーションの断定はできません。
• PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）法：培養サンプル中にマイコプラズマが存在していれば、そのDNAが増幅されます。PCRによるマイコプラズマ検出法は、日常的な細胞培養のメンテナンスにおいて信頼のある方法となっており、マイコプラズマ検出サービスを提供する会社や、細胞を貯蔵する機関やメーカーがストックを保護する方法として使用しています。良好に設計されたPCRプライマーは、偽陽性をなくすために重要で、これにより、コンタミネーションされていない大切な細胞を廃棄せずに済みます。この検査は、迅速に実施することも可能であり、潜在的なアウトブレイクがみられる状況において有用です。

PCR検査は極めて感度が高く、迅速に結果が得られるため、研究者は、マイコプラズマコンタミネーションが検出された場合、迅速に対応して単離し、除去することができます。 LookOut^®マイコプラズマPCR検出キットの感度は並外れており、その検出限界は、サンプル中において1 μLあたりわずか2ゲノムほどです。ワンステップPCRキットは、反応に必要なすべての試薬がそのPCRミックスに含まれている（プライマー、ヌクレオチド、ポリメラーゼ、および内部増幅コントロールを、すぐに使用できる凍結乾燥の反応ミックスとして提供）ため、ピペット操作を最低限にできる設計になっています。最適化されたPCRベースのマイコプラズマ検出方法の詳細をご覧ください。

DNAコンタミネーションは、マイコプラズマPCR検査の結果に影響を与える可能性があります。したがって、PCR環境由来のDNAコンタミネーションをなくすことが、正確なPCR検査を確実に行うために重要です。DNA除去スプレー（L8917）およびふき取り用ウェットティッシュ（L9060-50EA）の使用は、PCR環境の核酸コンタミネーションを排除するため、より正確なPCR結果が得られます。

マイコプラズマ除去法

マイコプラズマが検出された場合、培地からマイコプラズマを除去するか、細胞培養を最初からやり直します。細胞株はプロジェクトに重要である、または高価であるため、研究者はしばしば、コンタミネーション除去を望みます。

マイコプラズマ除去キットは、細胞培養のコンタミネーションの除去に簡便で有効な選択肢です。

マイコプラズマコンタミネーションの検出・予防・除去に必要な試薬消耗品