Analisi di proteine con la spettrometria di massa
La spettrometria di massa applicata alle proteine è largamente utilizzata nell’analisi di campioni biologici per l’individuazione di biomarcatori, le ricerche in proteomica e le applicazioni cliniche. In confronto ad altre tecniche utilizzate per la caratterizzazione delle proteine su larga scala, la spettrometria di massa è diventata uno strumento di primaria importanza in proteomica, data la sua idoneità alle analisi complesse.
La spettrometria di massa è impiegata per identificare e caratterizzare in maniera quantitativa le proteine sulla base della loro struttura, delle modificazioni post traduzionali che subiscono e delle interazioni cui danno luogo.
- L’identificazione delle proteine consiste tipicamente nel sottoporre a digestione chimica o enzimatica le proteine e generare così peptidi che sono poi analizzati mediante spettrometria di massa e identificati utilizzando metodi computazionali o di sequenziamento.
- Le modificazioni post traduzionali si possono individuare attraverso le variazioni nella massa dei residui amminoacidici. I siti modificati possono essere mappati attraverso metodi computazionali o di sequenziamento.
- Per l’analisi e la determinazione del profilo glicanico si fa uso di metodi enzimatici o chimici in grado di liberare le porzioni glicaniche delle glicoproteine, seguiti dalla derivatizzazione dei glicani liberi per l’analisi mediante spettrometria di massa.
- Le interazioni delle proteine sono determinate via co-purificazione per affinità della specifica proteina bersaglio con una qualsiasi proteina che interagisca con essa, oppure studiate a più ampio raggio utilizzando tecniche di cromatografia ad esclusione dimensionale o a scambio ionico, prima dell’analisi mediante spettrometria di massa.
Per la proteomica quantitativa, le proteine e i peptidi possono essere marcati chimicamente con isotopi stabili, utilizzando tecniche di marcatura isobarica TMT (Tandem Mass Tagging) e iTRAQ (Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation), oppure metabolicamente, mediante incorporazione di amminoacidi marcati (SILAC). La quantificazione relativa può essere ottenuta per confronto tra l’incorporazione di isotopi leggeri e quella di isotopi pesanti, mettendo in correlazione le intensità dei picchi rilevati mediante spettrometria di massa e le abbondanze delle proteine. Per la quantificazione assoluta, al campione in esame può essere fatta una piccola aggiunta (spiking) di standard puro di proteine o peptidi sintetici marcati isotopicamente, da sottoporre ad analisi mediante monitoraggio di reazione selezionata (SRM, Selected Reaction Monitoring).
Nella spettrometria di massa delle proteine, le masse di diversi peptidi e proteine sono determinate misurando il rapporto m/z (massa su carica) dei relativi ioni in fase gassosa. Gli spettrometri di massa convertono inizialmente le molecole delle proteine in ioni in fase gassosa per mezzo di una sorgente di ionizzazione. Un analizzatore di massa separa poi gli analiti ionizzati in base al rapporto m/z. Infine un rivelatore registra il numero di ioni per ogni valore del rapporto m/z. La ionizzazione per desorbimento laser assistita da matrice o MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization) e la ionizzazione elettrospray (ESI) sono le tecniche di spettrometria di massa comunemente utilizzate per ionizzare peptidi o proteine.
Spettrometria di Massa MALDI-TOF
La tecnica di ionizzazione MALDI fa uso di una matrice che assorbe energia laser per la generazione di ioni, riducendo così al minimo la frammentazione delle molecole proteiche. Per cominciare, il campione da analizzare viene disperso in una opportuna matrice. Successivamente, un laser pulsato irradia il campione, causando l’ablazione e il desorbimento del campione stesso e del materiale della matrice. Da ultimo, gli analiti vengono ionizzati, finendo protonati o deprotonati nel denso pennacchio di plasma (plume) generato dal laser, per essere poi avviati all’analisi spettrometrica.
Spettrometria di massa a ionizzazione elettrospray
La ionizzazione elettrospray (ESI) produce ioni per mezzo di un elettronebulizzatore (o elettrospray) in cui al campione liquido viene applicato un elevato voltaggio, originando così un aerosol di goccioline cariche da cui si generano gli ioni, con una frammentazione di peptidi e proteine ridotta al minimo. La ionizzazione elettrospray viene impiegata di preferenza in situazioni in cui alla spettrometria di massa viene abbinata la cromatografia liquida (LC-MS), dato che l’eluato cromatografico può alimentare direttamente l’elettronebulizzatore in un processo combinato.
Flusso di lavoro
Digestione e marcatura
Per tagliare le proteine in piccoli frammenti si ricorre a proteasi sito-specifiche, come la tripsina, così da permetterne l’identificazione confrontando gli spettri sperimentali con spettri teorici provenienti da specifici database o con standard di riferimento. Per la quantificazione relativa, le colture cellulari possono essere marcate metabolicamente mediante isotopi stabili, incorporati per somministrazione di amminoacidi marcati; in alternativa, è possibile marcare con isotopi stabili i campioni da analizzare mediante opportuni metodi chimici. Lo spiking con peptidi sintetici marcati isotopicamente rende possibile la quantificazione assoluta mediante monitoraggio di reazione selezionata (SRM).
Calibrazione e standardizzazione nella spettrometria di massa delle proteine
Gli standard di calibrazione possono servire da controllo per l’analisi del campione e possono essere utilizzati per determinare l’identità delle proteine, la sensibilità sperimentale e l’efficienza della digestione, oltre che come ausilio nella separazione cromatografica e nell’analisi quantitativa.
Separazione cromatografica
La cromatografia separa proteine e peptidi per ottenere campioni più facili da analizzare. Dato che in molti casi peptidi diversi possono esibire masse simili, è prassi comune impiegare l’HPLC per evitare di iniettare in contemporanea, nello spettrometro di massa, peptidi aventi masse molto simili o identiche, migliorando così il range dinamico complessivo delle misurazioni.
Rilevazione e analisi
Le proteine e i peptidi vengono ionizzati con tecniche MALDI o ESI prima di essere rilevate ed analizzate. Un analizzatore di massa distingue tra ioni basandosi sul valore dei rispettivi rapporti m/z. I pattern di frammentazione che ne risultano possono essere utilizzati per l’identificazione e i campioni possono essere sottoposti a quantificazione relativa, valutando i rapporti tra le intensità dei picchi a partire da campioni differenziati con marcatura isotopica, o a quantificazione assoluta, impiegando l’analisi SRM con standard interni marcati.
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