Purificazione dei campioni

Le tecniche di purificazione seguenti sono quelle più spesso usate in laboratorio per preparare i campioni prima delle successive analisi.

Dialisi

La dialisi è una tecnica di purificazione impiegata per rimuovere da un campione sali o altre molecole a basso peso molecolare. È anche usata per scambiare la composizione del tampone di un campione. La dialisi è una tecnica passiva che richiede grandi volumi di tampone.

Scambio di tampone e desalinizzazione

La desalinizzazione è una tecnica di purificazione impiegata per rimuovere da un campione sali o altre molecole a basso peso molecolare. Viene anche impiegata per lo scambio di tampone prima o dopo diversi stadi cromatografici e per la rimozione rapida dei reagenti quando si desidera terminare una reazione.

Precipitazione frazionata

La precipitazione frazionata è usata per rimuovere impurezze grossolane da piccoli volumi di campione. Le tecniche di precipitazione separano le frazioni secondo il principio della solubilità differenziale. Un aumento della concentrazione salina può aumentare le interazioni idrofobiche fra le proteine e causarne la precipitazione frazionata, poiché le diverse specie proteiche differiscono tra loro per il grado di idrofobicità.

Estrazione

La preparazione del campione via estrazione prevede l'isolamento degli analiti di interesse da un campione complesso o di volume molto maggiore. Tale processo consente di rimuovere i componenti del campione interferenti che potrebbero bloccare le colonne HPLC e GC. Inoltre, aumenta la concentrazione degli analiti di un fattore da 100 a 5.000, migliorando significativamente la sensibilità della rilevazione. In quanto parte di una preparazione del campione selettiva e specifica, l'estrazione aiuta ad assicurare analisi cromatografiche più affidabili. Esistono diversi tipi di estrazione: liquido-liquido, estrazione in fase solida (SPE) e microestrazione in fase solida (SPME).

Cromatografia d'affinità

La cromatografia d’affinità separa le proteine sulla base di interazioni reversibili fra una proteina e un ligando specifico immobilizzato in precedenza a una matrice cromatografica. La tecnica è molto selettiva e offre un’alta capacità di purificazione delle proteine.  La cromatografia d’affinità può essere impiegata ogni volta che sia disponibile un ligando adatto per la proteina di interesse.

La purificazione mediante cromatografia di affinità prevede due stadi: cattura ed eluizione. In fase di cattura, la proteina di interesse viene specificamente e reversibilmente legata a un ligando complementare immobilizzato su una matrice cromatografica. Lo scopo è quello di isolare, concentrare e stabilizzare il prodotto di interesse, preservandone potenza e attività. Dopo il lavaggio della fase stazionaria per rimuovere il materiale non legato, si recupera la proteina di interesse legata cambiando le condizioni in modo da favorirne l’eluizione. L'eluizione può essere specifica, per esempio con l'impiego di un ligando competitivo, o aspecifica se ottenuta cambiando il pH, la forza ionica o la polarità. L’eluizione consente la raccolta della proteina di interesse in forma purificata e concentrata.