重组细菌鉴定
蓝白斑筛选是一种快速有效的重组细菌鉴定技术，依赖于β-半乳糖苷酶的活性。β-半乳糖苷酶是一种在大肠杆菌中出现的酶，将乳糖切割成葡萄糖和半乳糖。
破坏LacZ 基因
周围环境中乳糖的存在触发了大肠杆菌中的lacZ操纵子。操纵子的活性导致产生代谢乳糖的β-半乳糖苷酶。大多数质粒载体携带lacZ基因的短片段，其含有β-半乳糖苷酶的前146个氨基酸的编码信息。使用的宿主大肠杆菌菌株是含有lacZΔM15缺失突变的感受态细胞。当质粒载体被这种细胞吸收时，由于α-互补过程，产生了功能性β-半乳糖苷酶。
这种α-互补过程作为重组的标记，以此操纵克隆中所使用的质粒载体。多克隆位点（MCS）存在于质粒载体的lacZ序列内。该序列可以被限制酶切口以插入外源DNA。当含有外源DNA的质粒载体被宿主大肠杆菌摄取时，不会发生α-互补，因此不会产生功能性β-半乳糖苷酶。如果外源DNA未插入载体，或者如果插入MCS以外的位置，则质粒载体中的lacZ基因补充宿主大肠杆菌中的lacZ缺失突变，产生功能性酶。
蓝白斑筛选的原理
为了筛选含有重组DNA的克隆，将X-gal生色底物加入到琼脂板中。如果产生β-半乳糖苷酶，则X-gal水解形成5-溴-4-氯-吲哚氧基，其自发二聚化而产生称为5,5'-二溴-4,4'-二氯-靛蓝的不溶性蓝色色素。由非重组细胞形成的菌落因此呈现蓝色，而重组细胞的菌落呈现白色。从而可以容易地挑选和培养所需的重组菌落。
异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）与X-gal一起用于蓝白斑筛选。IPTG是一种不可代谢的半乳糖类似物，可诱导lacZ基因的表达。应该注意的是，IPTG不是β-半乳糖苷酶的底物，而只是诱导物。为了视觉筛选目的，需要像X-gal那样的生色底物。
图 1.可用于蓝白斑筛选的典型质粒载体的示意图。
图 2.典型的蓝白斑筛选程序的示意图。
蓝白斑筛选产品（材料）
蓝白斑筛选的实验方案
蓝白斑筛选的完整实验方案包括3个重要步骤：
- 连接：将外源DNA连接到质粒载体的MCS中
- 转化：将含有外源DNA插入物的质粒载体转化到感受态大肠杆菌中
- 筛选：蓝白斑筛选，以鉴定重组细菌菌落
连接
Sigma-Aldrich提供以下即用型表达载体，可用于稳定和瞬时表达系统。这些FLAG-融合构建体具有在细菌和哺乳动物细胞中繁殖的复制起点。
所需材料
以下是连接的反应条件
- 将上述所有组分加入到干净的反应管中。
- 在25°C下孵育30分钟（可在热循环仪中进行）。
- 使用PCR纯化柱纯化DNA，并以约50 μL洗脱。
- 将0.1-10 ng的连接产物转化为与载体相容的化学或电感受态细胞。
转化
高质量的质粒对转化过程至关重要。以下是Sigma-Aldrich提供的用于分离和纯化适合转化的高质量质粒的试剂盒。
关于化学或电感受态细胞转化的详细实验方案，请参见此处。
筛选
Sigma-Aldrich提供一系列有助于筛选重组细菌的生色底物。一些产品可用于在LB琼脂板上铺展（筛选实验方案1），另一些产品则可掺入微生物培养基中（筛选实验方案2）。产品在需要时与IPTG一起使用。这两个实验方案的详细步骤如下。
筛选实验方案1（适用于产品编号B6650、16658、B2904、B3928、16669、B8931）
- 使用无菌涂布器在LB琼脂板上涂布40 μL或适量的生色底物和10 μL IPTG溶液的原液（当使用产品编号B3928时不需添加IPTG，因为它已经含有IPTG）。
- 琼脂板应包括含有适当抗生素和不含抗生素的对照。
- 将板置于层流室中干燥，盖子略微打开。
- 使用无菌涂布器将10-100 μL已转化的大肠杆菌细胞涂布到LB琼脂板上。
- 将板在37°C孵育24-48小时。
- 琼脂表面出现蓝色和白色菌落。选择白色菌落中的重组细胞进行培养。
筛选实验方案2（适用于产品编号S7313、S9811、C4478）
- 制备LB琼脂：称重适量粉末培养基、琼脂和水，将其添加到无菌瓶中。也可称取适量C4478，添加到有水的无菌瓶中。
- 高温高压灭菌之前，将300 mg/L产品编号S7313和S9811以及500 mg/L柠檬酸铁铵（产品编号F5879）添加到培养基中。如果使用C4478，则省却该步骤。
- 将培养基高温高压灭菌，并冷却至瓶子刚好不烫手的温度。
- 向培养基中加入适当浓度的选定抗生素。
- 将约25-30 mL的LB琼脂倒入无菌板让其凝固，期间使盖子稍微打开。
- 使用无菌涂布器将10-100 μL已转化的大肠杆菌细胞涂布到LB琼脂板上。
- 将板在37°C孵育24-48小时。
- 琼脂表面出现蓝色和白色菌落。选择白色菌落中的重组细胞进行培养。
图 3.用X-gal对重组细菌进行蓝白斑筛选。
蓝白斑筛选的局限性
- 蓝白斑技术只是一种筛选程序，不是一种选择技术。
- 载体中的lacZ基因有时可能不起作用而无法产生β-半乳糖苷酶。得到的菌落不是重组的，但仍呈现白色。
- 即使有小序列的外源DNA插入到MCS中并改变lacZ基因的读码框。这导致假阳性白色菌落。
- lacZ的读码框内的小插入物可能产生模糊的浅蓝色菌落，因为β-半乳糖苷酶仅部分失活。
参考文献
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