Duolink™多孔板检测

关于DUOLINK™荧光原位检测使用说明书的改动建议

使用Duolink™试剂染色多孔板培养细胞时，需要对适合玻片样本染色的Duolink™实验方案做一些改动，使其适合多孔板形式。其中，洗涤程序、成像准备和孔板扫描都与标准方案不同。在96孔多孔板中染色细胞时，建议仔细通读Duolink™荧光原位检测使用说明书，再按照下述指南修改实验方案。根据特别的应用需求或检测设计，也可进行其他改动。

推荐设备

• PerkinElmer^® ViewPlate 96孔板，黑色，底透（PerkinElmer，货号6005182，50/箱）或类似孔板
• 塑料多孔板盖、塑封膜或Parafilm^®封口膜
• 水平摇床，用于孵育和洗涤步骤
• Cellomics ArrayScan或其他高分辨率激光扫描显微镜
• Duolink™原位微孔板细胞核染色剂和抗淬灭剂(DUO82064)
• Duolink™原位微孔板传热块(DUO82065)

预处理，封闭和一抗

按照平时的免疫染色标准方案在多孔板中培养并处理（饥饿、刺激等）、洗涤和固定细胞。一抗条件的优化应综合考虑样本固定、抗原修复、封闭溶液、抗体稀释剂、浓度、孵育温度和时间。

孵育步骤

建议每孔加入40 μl试剂。孵育时，用塑料板盖、塑封膜或Parafilm封口膜盖住板子，防止样本变干。在预热的微孔板传热块(Heat Transfer Block)中孵育可提高染色效率和板间重复性，并减少微孔板边缘效应。建议孵育时将板子置于水平摇床上（最高 240 rpm），提高染色均匀性。

洗涤步骤

每次洗涤建议每孔至少加入200 μl 1x洗涤缓冲液。可手动洗涤，也可通过微孔板细胞清洗模块自动进行。加入新试剂前，尽量除尽残留洗涤缓冲液以避免干扰。同时也要保持样本不要过干，并确保洗涤不会过于剧烈以免细胞脱落。每次清洗后，让样本在洗涤缓冲液中浸泡一会后再弃液，例如，在 2 x 5 min清洗时：加液200 μl清洗并浸泡5 min，吸去液体，接着再加200 μl清洗并浸泡5 min再吸去液体，最后加入新试剂。在使用洗涤缓冲液B的最终洗涤步骤中，让样本在1x洗涤缓冲液B中浸泡2 x 10 min，再进行成像准备。

成像准备

为了进行DAPI细胞核染色并保护PLA信号，可使用含细胞核染色剂缓冲液(10x)和抗淬灭剂缓冲液(10x)的微孔板细胞核染色剂和抗淬灭剂试剂盒。完成1x洗涤缓冲液B的2 x 10 min最终洗涤后，即开始本节程序：

1. 将细胞核染色剂缓冲液升至室温。
2. 向小瓶加入9.0 mL超纯水，配成1x细胞核染色剂缓冲液。
3. 让样本在1x洗涤缓冲液A中浸泡2 min。
4. 弃去洗涤缓冲液，按50 μl /孔加入1x细胞核染色剂缓冲液。
5. 37 °C孵育30 min。孵育快结束时，将抗淬灭剂缓冲液升至室温。
6. 向小瓶加入9.0 mL超纯水，配成1x抗淬灭剂缓冲液。
7. 让样本在1x洗涤缓冲液A中浸泡2 min。
8. 弃去洗涤缓冲液，按50 μl/孔加入1x抗淬灭剂缓冲液。
9. 扫描微孔板。

为了防止液体随着长时间的扫描而蒸发，用塑封膜密封板子。扫描板应4 °C避光保存。4 °C储存的信号可维持一周。

孔板扫描

采用适合所用显微镜的扫描设置，并确保选用合适的滤光片用于图像采集。至少放大20倍。为了比较各孔数据，需要固定信号通道的曝光时间。扫描分辨率最好设为0.25 μm /像素，至少0.45 μm /像素。

384孔板相关建议

使用PerkinElmer^® ViewPlate 384孔板，黑色，底透（PerkinElmer，货号6007460，40/箱）或类似孔板，每孔至少15 μl试剂。由于TWEEN^® 20容易产生气泡清洗时要小心，采用TBS替代可能有所帮助。也可稍微离心一下板子去除气泡。移液时将板子置于冰上并在37 °C孵育时将板子置于微孔板传热块上预热，可以避免板内染色不均的问题。

参考文献

1. Leuchowius K, Jarvius M, Wickström M, Rickardson L, Landegren U, Larsson R, Söderberg O, Fryknäs M, Jarvius J. 2010. High Content Screening for Inhibitors of Protein Interactions and Post-translational Modifications in Primary Cells by Proximity Ligation. Mol Cell Proteomics. 9(1):178-183. https://doi.org/10.1074/mcp.m900331-mcp200