如何创建PLA®探针

利用原位PLA技术扩展可能性

Duolink™试剂盒使用原位PLA^®技术（一种邻位连接检测技术）准确、客观地量化单个蛋白质，以及这些蛋白在未修饰细胞和组织中的互作和修饰。该技术具有无与伦比的特异性和灵敏度对蛋白互作进行直接检测-低至单分子分辨率。Duolink™原位Probemaker通过允许您创建自己的 PLA 探针来满足特定的检测要求，从而进一步扩展了您的可能性。

• 研究同源二聚体
• 研究来源于同一物种的两种一抗的蛋白质-蛋白质相互作用
• 研究与任何物种一抗的蛋白质-蛋白质相互作用

使用Duolink™原位探针标记PLUS和MINUS，您可以快速方便地将PLUS和MINUS寡核苷酸臂直接偶联到抗体上。其除了可提供独特的功能外，这也意味着您不再需要限制一抗必须来自哪个物种才能进行Duolink™检测。为了进行完整的Duolink™检测，您只需要将一个Duolink™原位探针标记PLUS、一个Duolink原位探针标记MINUS和相应的Duolink原位检测试剂组合在一起即可。

研究同源二聚体

Duolink™原位探针标记通过标记两种单克隆抗体，从而帮助您对同源二聚体复合物进行研究。您只需将PLUS寡核苷酸标记一个单体，用MINUS 寡核苷酸标记另一个单体即可（图1）。

图 1. 同型二聚体的检测。

使用来自同一物种的抗体

使用来自相同物种的两种一抗对蛋白-蛋白互作、蛋白质修饰或单一蛋白进行研究。您只需将PLUS寡核苷酸标记一种抗体，用MINUS 寡核苷酸标记另一种抗体即可（图2）。

图 2. 使用来自相同物种的一抗检测蛋白互作。

使用来自任何物种的抗体

使用来源于除小鼠、兔或山羊以外的物种的一种或两种一抗对蛋白-蛋白互作、蛋白质修饰或单一蛋白进行研究。您只需将PLUS寡核苷酸标记一种二抗，用MINUS 寡核苷酸标记另一种二抗，或将一种标记的二抗与标准二级Duolink™原位PLA探针组合即可（图3）。

图 3. 使用来源于除小鼠、兔或山羊以外的物种的一种或两种一抗研究蛋白互作。

应用实例

用于磷酸化研究的相同物种抗体

磷酸特异性抗体因能与高度相关的保守激酶靶位点的高水平非特异性结合而臭名昭着，严重影响了磷酸化研究的数据。Duolink™通过使用一种针对靶蛋白的一抗和一种针对特定磷酸化位点的一抗的双重识别来克服该问题。在该应用实例中，Duolink™原位探针标记与两种小鼠抗体一起使用，一种针对EGFR蛋白，一种针对磷酸化酪氨酸。

图 4. 使用Duolink™原位探针标记检测磷酸化EGF受体。通过A431细胞中的原位PLA（红色PLA信号）检测EGFR磷酸化。A431细胞未经处理（A），或用rhEGF刺激2分钟（B）。根据Duolink™探针标记的说明，使用Duolink™原位探针标记PLUS和MINUS将两种一抗（一种针对EGFR蛋白，另一种针对磷酸化酪氨酸）直接偶联至特定的DNA链上。随后用抗肌动蛋白（绿色）和DAPI（蓝色）对细胞进行复染，以分别显示出细胞质和细胞核。

图 5. 单细胞统计分析- A431细胞中磷酸化EGFR的定量。每个数据点代表未处理和用rhEGF刺激的细胞中存在磷酸化EGF受体的细胞。使用Duolink™成像工具进行定量。

抗体要求

• 浓度和体积：待偶联的抗体必须具有1 mg/mL的浓度。不要使用高于20 μL的体积进行结合。
• 缓冲液：抗体必须在无胺缓冲液中（最好是PBS）。缓冲液应是无载体的，但可含有不超过0.1％的BSA、5％的海藻糖或0.02％的叠氮化钠。

储存温度

将未使用的试剂盒-20°C储存。偶联后的抗体推荐储存温度为2-8 °C。

Duolink™原位探针标记PLUS和MINUS试剂盒包括所有必需的试剂、缓冲液、以及Duolink™寡核苷酸臂与抗体结合所需的溶液。对于完整的Duolink™测定，您还需要Duolink™原位检测试剂（荧光或明场）。