β-NAD和β-NADH的回收微量分析

1.目的

建立β-NAD和β-NADH的回收微量分析的标准化操作流程。

2.范围

本操作流程适用于对β-NAD和β-NADH进行回收微量分析的所有产品。

3.定义

纯水 – 来自去离子系统的水，电阻率>或=18MΩ•cm @25 ºC

β-NADH = β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，还原形式

 β-NAD = β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，氧化形式

 MTT = (3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基溴化四唑)

PES =吩嗪乙基硫酸盐

4.讨论

β - NAD + 乙醇 ^{乙醇脱氢酶} > β-NADH + 乙醛
β-NADH + MTT + PES → 显色染料 + β - NAD

5.责任

分析服务人员应遵循本书面实验方案。

6.安全

有关危险因素及合适的操作注意事项，参阅安全数据说明书（SDS）。

7.操作流程

7.1.条件：PH = 7.8，T = 25 °C，A570 nm，光程 = 1 cm

7.2.方法：连续光谱法速率测定

7.3.试剂：

7.3.1.   1 M二甘氨酸（货号B3876）
采用纯水配制成163.2 mg/mL溶液。可能需要涡旋加速溶解。须现配现用。

7.3.2.   200 proof乙醇 (货号459828）

7.3.3.   0.1 M 乙二胺四乙酸（EDTA）
采用纯水和乙二胺四乙酸四钠水合物（货号ED4SS）配制41.6 mg/mL的溶液。可能需要涡旋加速溶解。

7.3.4.   20 M吩嗪乙基硫酸盐（PES；货号P4544）
采用纯水配制成6.7 mg/mL的吩嗪乙基硫酸盐溶液。可能需要涡旋加速溶解。须现用现配并存放在冰上。此试剂会快速降解，因此请在溶解后两小时内使用。

7.3.5.   10 mM (3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基溴化四唑（MTT）
采用纯水和(3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基溴化四唑（货号M2128）配制成4.1 mg/mL的溶液。可能需要涡旋和/或超声处理加速溶解。实验期间试剂须遮光室温保存。

7.3.6.   0.045 mM β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，氧化形式(β-NAD)
利用低温纯水和β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（货号N1636）配制成0.045 mM的溶液。校正特定批次的水含量。请使用A类容积式玻璃容器。可能需要超声处理加速溶解。此试剂应现配现用。

7.3.7.   待测溶液（试样）
利用低温纯水配制待测溶液，等待Δ A_570nm/min ≤ 0.1的情况持续5分钟时间窗。此反应主要采用乙醇脱氢酶(ADH)进行。对于ADH，蛋白浓度通常为1-10 mg/mL之间。

7.3.8.   120 mM二甘氨酸，3.7% ETOH，5 mM EDTA（RC）
在A类定容玻璃容器中，通过混合以下成分(ml)配制反应混合物：

	(RC)
试剂7.3.1	12.0
试剂7.3.2 (ETOH)	3.7
试剂7.3.3（EDTA）	5.0
纯水	79.3

在25 °C下，采用1 M 氢氧化钠（货号S2567）或1 M盐酸（货号H3162）将pH调节为7.8。

7.4.操作流程

7.4.1.   采用适宜的恒温分光光度计，在25 °C下按照下表所列的具体顺序，依次将以下成分加入到适宜的反应容器中。试剂7.3.4、试剂7.3.5和试剂7.3.6应尽可能依次快速加入。可能需要进行多次浓度测试。

空白样	试样1	试样2	标准样1	标准样2	标准样3
RC（试剂7.3.8）	2.50	2.50	2.50	2.50	2.50
纯水	0.10	------	------	------	------
试样（试剂7.3.7）	------	0.10	0.10	0.10	0.10
PES（试剂7.3.4）	0.25	0.25	0.25	0.25	0.25
MTT（试剂7.3.5）	0.13	0.13	0.13	0.13	0.13
β-NAD（试剂7.3.6）	------	------	------	0.005	0.010

立即倒置混匀，并记录6分钟内的A_570nm增量。获取5分钟时间窗内的所有水平的Δ A_570nm/min。

7.5.   计算

7.5.1.   标准曲线：
校正后的标准样A_570nm/min = (标准样ΔA_570nm/min – 空白样ΔA_570nm/min – 试样ΔA_570nm/min)

其中：试样ΔA_570nm/min为7.5.2中测定的所有试样校正后的ΔA_570nm/min平均值。
分别采用校正后的标准样Δ A_570nm/min以及标准样中的β-NAD/反应混合物纳摩尔数作图，测定直线的斜率、Y轴截距以及相关系数值。相关系数值应达到0.99以上。

7.5.2.   试样测定：
校正后的试样ΔA_570nm/min = (试样ΔA_570nm/min – 空白样ΔA_570nm/min)
使用标注曲线并对90%一致性试样结果求平均，确定β-NAD/试样的纳摩尔数。

ADH纳摩尔数	=	(0.100)(10.0)(mg 蛋白/mg 固体)(1,000,000)
试样		分子量

β-NAD摩尔数	=	β-NAD/试样纳摩尔数
ADH摩尔数		ADH/试样纳摩尔数

0.100 = 反应混合物中使用的试剂7.3.7（试样）体积(ml)
10.0 = 试剂7.3.7（试样）浓度（mg固体/mL）
mg蛋白/mg固体 = 基于E1% 、280 nm的蛋白测定结果。
1,000,000 = 从mg至ng的换算系数
分子量 =试剂7.3.7（试样）分子量。马肝脏来源乙醇脱氢酶的分子量等于160,000，面包酵母来源乙醇脱氢酶的分子量等于 141,000。

7.5.3.   货号A3263参数适于回收微量分析β-NAD和β-NADH。适用于标准依据如下条件确定：由于A7011已经结合β-NAD和β-NADH、A3263理应少量结合β-NAD和β-NADH，如果β-NAD/ADH的摩尔比低于A7011中的β-NAD/ADH平均摩尔比的1/10，则视为A3263适用。