DNA和蛋白质去磷酸化操作流程

蛋白质和DNA去磷酸化

去磷酸化指的是水解去除磷酸(PO₄³⁻)基团的过程。在对蛋白质或DNA去磷酸化时，需要使用酶或水解酶切割酯键。例如，磷酸酶可将磷酸单酯水解为磷酸根离子和带有游离羟基(OH)基团的分子，从而去除磷酸基团。 

去磷酸化操作流程

操作流程	推荐产品
1.利用小牛肠碱性磷酸酶对DNA进行去磷酸化	P4978
2.利用虾碱性磷酸酶对DNA进行去磷酸化	P9088
3.利用牛肠碱性磷酸酶对蛋白进行去磷酸化	P0114

 

1.利用小牛肠碱性磷酸酶对DNA进行去磷酸化

材料

牛小肠碱性磷酸酶（货号 P4978）
10X CIP缓冲液（货号C3225）
1 M NaCl
0.5 M Tris-HCl，25 °C下pH 7.9
0.1 M MgCl₂
0.01 M 二硫苏糖醇

存储缓冲液

10 mM Tris-HCl, pH 8.2
50 mM KCl
1 mM MgCl₂
0.1 mM ZnCl₂
50%甘油

操作流程：

1. 1X CIP缓冲液溶解DNA(0.5 µg DNA/10 µL)。
2. 对于5’突出的粘末端DNA加入0.1单位/皮摩尔的CIP；对于3'突出的粘末端或布路姆试剂加入1单位/皮摩尔。
3. 在37℃孵育60分钟。
4. 苯酚/氯仿²（货号P3803 或P2069）提取或凝胶纯化DNA。*
5. 乙醇沉淀法恢复DNA。²

*注意：苯酚提取或凝胶纯化后无需再热灭活。

热灭活：对于牛肠酶，在5毫摩尔/升的乙二胺四乙酸下，加热至75℃10分钟，可使95%以上的活性失活。 注意：大肠杆菌的碱性磷酸酶比牛肠酶在高温下更稳定，也更耐热灭活。

参考文献

1. MÖSSNER E, BOLL M, PFLEIDERER G. 1980. Purification of Human and Bovine Alkaline Phosphatases by Affinity Chromatography. Hoppe-Seyler´s Zeitschrift für physiologische Chemie. 361(1):543-550. https://doi.org/10.1515/bchm2.1980.361.1.543

2. Sambrook Jea. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. p 5.72, 6.22-6.47 and E.3-E.13.. Cold Spring Harbor Laboratory.

 

2.利用虾碱性磷酸酶对DNA进行去磷酸化

虾碱性磷酸酶（货号A2237）以50％甘油的溶液形式提供，其中含有25mM Tris-HCl (pH 7.6)、1mM MgCl₂和0.1mM ZnCl₂。

可采用含5 mM MgCl₂的0.05 M Tris-HCl (pH 8.5)配制稀释液。

在0.05 M Tris-HCl、5 mM MgCl₂、pH 8.5条件下进行去磷酸化。

热灭活：去磷酸化反应后，再升温至60℃15分钟即可使酶失活。

参考文献

1. Olsen RL, Øverbø K, Myrnes B. 1991. Alkaline phophatase from the hepatopancreas of shrimp (Pandalus borealis): A dimeric enzyme with catalytically active subunits. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Comparative Biochemistry. 99(4):755-761. https://doi.org/10.1016/0305-0491(91)90139-5

2. Sambrook J, Russell D. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

3. Takanami M. 1967. Analysis of the 5?-terminal nucleotide sequences of ribonucleic acids. Journal of Molecular Biology. 23(2):135-148. https://doi.org/10.1016/s0022-2836(67)80022-6

 

3.利用牛肠碱性磷酸酶对蛋白进行去磷酸化

操作流程：将100单位碱性磷酸酶（货号P0114）与400μg蛋白在5 mM Tris（pH 7.9）、10 mM NaCl、1 mM MgCl₂和0.1mM DTT条件下30°C孵育30分钟。

1. Labugger R, Organ L, Collier C, Atar D, Van Eyk JE. 2000. Extensive Troponin I and T Modification Detected in Serum From Patients With Acute Myocardial Infarction. Circulation. 102(11):1221-1226. https://doi.org/10.1161/01.cir.102.11.1221

参考文献

1. Labugger R, Organ L, Collier C, Atar D, Van Eyk JE. 2000. Extensive Troponin I and T Modification Detected in Serum From Patients With Acute Myocardial Infarction. Circulation. 102(11):1221-1226. https://doi.org/10.1161/01.cir.102.11.1221