间充质干细胞培养方案

间充质干细胞的分离
人间充质干细胞的扩增
人间充质干细胞的分化
常问问题解答

间充质干细胞（MSC）具有多谱系分化的能力，产生多种间充质表型，例如成骨细胞（骨）、脂肪细胞（脂肪）和软骨细胞（软骨）。干细胞疗法具有实现下一代未来医学突破的巨大前景。在这方面，多能祖细胞，例如hMSC，由于其能够分化成各种细胞类型的能力以及其免疫调节特性，而引起了很高的临床兴趣。总之，这些特性使得能够同种异体使用hMSC，从而使它们成为商业治疗开发中颇有吸引力的目标。下面将给出干细胞培养中正确分离、扩增和分化MSC的实验方案的详细步骤。

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方法

间充质干细胞的分离

目前已可从多种组织中分离出间充质干细胞，包括人骨髓、脂肪组织、脐带和牙髓。以下是一个简单的通用实验方案，可用于从各种组织来源获得MSC。

注意：MSC种群因供体而异，可能需要进一步优化。

1. 取适量在无菌条件下收集的新鲜组织抽吸物。
2. 用70 mm滤网（CLS431751）过滤细胞悬液以去除任何细胞团块。
3. 在台式离心机中将细胞以500g沉淀5分钟。
4. 重悬细胞，并用台盼蓝(T8154)排除法确定细胞的产量和活力。
5. 在10 ml完全MSC培养基 (SCM015 or SCM045)中以25 × 10⁶细胞/ml的密度在T75培养皿中培养细胞。将板在37℃、5％CO₂下在加湿培养箱中静置孵育。
6. 3小时后，更换培养基，换成10 ml新鲜的完全培养基，除去积聚在培养皿表面上的非粘附细胞。
7. 再培养8小时后，用10 ml新鲜的完全培养基更换培养基。此后，每8小时重复该步骤，直至完成72小时的初始培养。
8. 细胞可以2 × 10⁶个细胞/小管的密度混入MSC生长培养基及10％ DMSO（D2650）中冷冻。

人间充质干细胞的扩增

A. 包被培养板的制备

组织培养用塑料培养板或玻璃器皿应该涂上0.1％明胶，如下如述：

1. 加入足够的0.1％明胶溶液(ES-006-B) 以覆盖培养器皿的整个表面。对10 cm板和T75培养瓶，用10 mL体积。在室温下孵育至少30分钟。
2. 在使用前，从包被培养板或培养瓶中吸去明胶溶液。

B. 间充质干细胞的解冻

1. 必须等到准备好推荐的培养基和适当涂有0.1％明胶的塑料培养板和/或玻璃器皿之后才解冻细胞。
2. 从液氮中取出人间充质干细胞（SCC034、SCC038）小管，并在37℃水浴中孵育。密切观察，直到细胞完全解冻。是否获得最大细胞活力取决于冷冻细胞是否快速和完全解冻。
   
   重要提示：请勿涡旋细胞。
   
   
3. 一旦细胞完全解冻，立即用70％乙醇对小瓶外部进行消毒。立即进行下一步。
4. 在层流罩中，用1或2 mL移液管将细胞转移到无菌的15 mL锥形管中。在转移过程中小心不要引入任何气泡。
5. 用10 mL移液管，缓慢滴加预热至37°C的9 mL间充质干细胞扩增培养基 (SCM015 or SCM045)或合适的替代品至15 mL锥形管。
   
   重要提示：请勿将全部培养基一次性添加到培养孔中。由于渗透压冲击，这样做可能导致细胞活力降低。
   
   
6. 缓慢上下吹吸两次以轻轻混合细胞悬液。小心不要引入任何气泡。
   
   重要提示：请勿涡旋细胞。
   
   
7. 将试管以300 × g离心2-3分钟以沉淀细胞。
8. 尽可能多地倒出上清液。步骤5-8对于去除残留的冷冻保存剂（DMSO）是必要的。
9. 将细胞重悬于已预热至37°C的总体积为10 mL的间充质干细胞扩增培养基 (SCM015 or SCM045) 或合适的替代品中，其中含有新鲜添加的8 ng / mL FGF-2（F0291 ）。
10. 将细胞悬液接种到10 cm组织培养板或T75组织培养瓶上。
    
    重要提示：接种密度应为5,000-6,000个细胞/cm²
    
    
11. 将细胞置入37℃、用5％ CO₂平衡的加湿培养箱中。
12. 第二天，用含有8 ng/mL FGF-2的新鲜间充质干细胞扩增培养基（预热至37℃）更换培养基*。每两至三天更换一次含有FGF-2的新鲜培养基。
13. 当细胞达到大约80％的汇合时，可以用胰蛋白酶-EDTA (SM-2003-C) 将它们分离，并进一步传代或冷冻以备后用。
    
    注意：根据接种密度和传代数（即之后的传代代数），细胞可能需要更长时间才能达到80％的汇合度。

C. 间充质干细胞的扩增

1. 一旦细胞达到约80％的汇合并且正在积极增殖时，传代培养细胞。
   
   重要提示：在达到100％汇合之前进行传代细胞培养。
   
   
2. 小​​心地从含有人间充质干细胞汇合层的10 cm组织培养板中取出培养基。涂抹3-5 mL胰蛋白酶-EDTA溶液 (SM-2003-C)，并在37℃培养箱中孵育3-5分钟。
3. 用手掌轻轻拍板的侧面，检查板上的细胞完全脱离。
4. 向板中加入5 mL间充质干细胞扩增培养基 (SCM015 or SCM045)。
5. 轻轻旋转培养板以混合细胞悬液。将解离后的细胞转移到15 mL锥形管中。
6. 将试管以300 × g离心3-5分钟以沉淀细胞。
7. 丢弃上清液。
8. 将含有8 ng/mL FGF-2的2 mL间充质干细胞扩增培养基（预热至37°C）加于锥形管，并彻底重悬细胞。
   
   重要提示：请勿涡旋细胞。
   
   
9. 使用血细胞计数器计数细胞。
10. 将细胞以5,000-6,000个细胞/cm²的密度接种到含有8 ng/mL FGF-2的间充质干细胞扩增培养基的适当培养瓶、板或孔中。
11. 细胞可以2 × 10⁶个细胞/小管的密度混入MSC生长培养基及10％ DMSO（D2650）中冷冻。

图 1. 解冻后一天（A）和两天（B）后的人间充质干细胞的阶段对比图。注意纺锤形、成纤维细胞样的形态。在传代之前，细胞应该达到约80％汇合。

图 2. 用人间充质干细胞表征试剂盒中提供的抗体培养的人骨髓来源的间充质干细胞的ICC染色。人间充质干细胞表达H-CAM（CD44）（A，CBL154；1/500稀释）、THY-1（CD90）（B，CBL415；1/500稀释）和STRO-1（C，MAB4315：1/500稀释）。用DAPI（蓝色）显示的细胞核。人间充质干细胞中未观察到造血干细胞标志物CD19（MAB1794）和CD14（MAB1219）和内皮标志物CD146（MAB16985）的表达（数据未显示）。

人间充质干细胞的分化

间充质干细胞的成骨作用

取用一个人纤连蛋白、20 μg/mL（FC010）或0.1％明胶(ES-006-B) 包被的48孔组织培养板，在0.5 ml常规MSC生长培养基 (SCM015 or SCM045)中接种20K细胞/孔。孵育过夜后，用OsteoMAX-XF™分化培养基 (SCM121)更换培养基。每2-3天更换一次培养基，共计14-21天。茜素红（TMS-008）染色的骨细胞将在第7天左右开始形成，在第14天左右达到最大表达。

间充质干细胞的脂肪形成作用

取用一24孔组织培养板，在1 ml常规MSC生长培养基 (SCM015 or SCM045)中接种60K细胞/孔。孵育过夜后，用AdipoMAX™分化培养基（SCM122）更换培养基。每2-3天更换一次培养基，共计14-21天。每2-3天更换一次培养基，共计14-21天。油红-O (O1391)染色的脂肪细胞将在第14天左右开始形成，在第21天左右达到最大表达。

间充质干细胞的软骨形成作用

可以使用聚集体中细胞的三维微团培养物诱导间充质干细胞分化成软骨细胞。

1. 在5 mL预热的ChondroMAX™分化培养基（SCM123）中重悬2.5 x 10⁵个MSC。
2. 将细胞以200g离心5分钟。
3. 去除培养基，用0.5 mL预热的ChondroMAX™分化培养基重悬细胞。
4. 将细胞以200g离心5分钟。请勿去除培养基。
5. 拧松管盖以便换气，并在37°C、5％CO₂直立孵育。
6. 1-2天后，细胞沉淀团开始形成直径约1-2mm的圆球。每隔一天小心更换培养基，不要破坏细胞的微团块。 21天后，即可固定、切片和用番红-O (TMS-009)、阿尔新蓝（TMS-010）或抗体染色以鉴定软骨细胞。

图 3. 用油红-O（脂肪细胞）、茜素红（骨细胞）、番红-O（软骨细胞）和阿尔新蓝（软骨细胞）染色分化的人间充质干细胞培养物。

常问问题解答

1. MSC在培养基中扩增多久？建议从低传代数细胞（≤P 2）开始，因为MSC很少扩增超过第5-10代（10次群体倍增）。
2. 我的细胞不再繁殖，我该怎么办？建议从新的一小管新鲜的低传代细胞开始培养。
3. 多能MSC的典型形态是什么？  MSC应具有纺锤形 / 成纤维细胞样形态。细胞在衰老时变得更大并且成纤维细胞更少。
4. 可以使用哪些标记来表征MSC？  MSC均匀表达整联蛋白CD29、基质受体CD44、CD105、以及基质细胞相关标志物CD73、CD90和CD166。细胞对造血谱系标志物CD14、CD31、CD34和CD45呈阴性。
5. 我如何知道何时分离我的MSC？当细胞汇合不超过80％时分离细胞。
6. 传代MSC时使用的正确接种密度是多少？我们建议用5000个细胞/cm²的密度接种新板。
7. 我可以使用FBS培养MSC吗？含有低浓度FBS（<1％ FBS）的培养基可用于扩增MSC。但是，由于其不确定性，必须对每批FBS进行筛选以支持MSC增长。我们建议使用PLTMax^®人血小板裂解液（SCM141）或不含Xeno的MSC培养基（SCM045），它们不需要这种预筛选。