Proteinaffinitätschromatografie
Affinitätschromatografie ist das bevorzugte Verfahren der bioselektiven Adsorption und anschließenden Rückgewinnung einer Verbindung von einem immobilisierten Liganden. Jede ist für die hochgradig spezifische und effiziente Aufreinigung von Proteinen und verwandten Verbindungen konzipiert. Unser Angebot umfasst entsprechend selektive Liganden auf kugelförmigen und porösen Matrizen zum Binden von Zielverbindungen, die anschließend unter milden Bedingungen rückgewonnen werden. Ihre Wahl für eine optimale Downstream-Nutzbarkeit.
Aktivierte/funktionalisierte Matrizen
Die Verfügbarkeit von voraktivierten Trägern ermöglicht es dem Anwender, individuelle Affinitätsharze schnell und einfach zu synthetisieren, ohne hochreaktive Reagenzien handhaben zu müssen. Unser Angebot umfasst verschiedene aktivierte Matrizen, die für die direkte Kopplung an eine Vielfalt von Liganden bereit sind. Der Ligand muss allgemein eine freie primäre Amin-, Sulfhydryl- oder Hydroxygruppe für die direkte Bindung aufweisen. Die Eigenschaften des Liganden sind ein wichtiger Faktor bei der Wahl der geeigneten Matrix.
Historisch waren mit Bromcyan aktivierte Matrizen sehr beliebt. Ihre Fähigkeit, Aminfunktionalitäten unter milden Bedingungen effizient zu koppeln kompensierte für viele die Probleme der Ligandenauslaugung und der ionischen Eigenschaften, die mit dieser Chemie assoziiert sind. Wir haben viele alternative aktivierte Harze mit Kopplungschemien, die sich für die stabile Bindung an die meisten Arten von potenziellen Liganden eignen, im Angebot. Verschiedene Aktivierungschemien verleihen der Reaktivität und Funktionalität der Affinitätsmatrix einzigartige Eigenschaften. Die wichtigsten Eigenschaften für jede direkte Aktivierungsart werden in der beiliegenden Tabelle beschrieben.
Einige aktivierte Matrizen, die verfügbar sind, enthalten aufgrund einer vorherigen Derivatisierung einen zusätzlichen Spacer. Diese Harze können die Verwendung milder Kopplungsbedingungen oder eine spezifischere Bindung eines Liganden ermöglichen. Beispiele dieser sind Folgende:
Unser Angebot umfasst Matrizen mit eingebrachten Endgruppen, die sich für eine individuelle Derivatisierung oder Kopplung eignen. In der Regel haben diese Gruppen eine Carboxyl- oder Aminfunktionalität, die durch eine Amidbindung an einen Liganden gekoppelt werden kann, und erfordern ein zusätzliches Reagens für die Kondensation. Eine weitere häufig verwendete Gruppe ist Hydrazid, das durch eine Hydrazonbildung an Aldehyde koppeln kann und in der Regel kein zusätzliches Reagens erfordert.
Aminosäurenharze
Unser Angebot umfasst verschiede Aminosäuren, die durch Aminogruppen an mit Bromcyan aktivierte 4 % Agaroseperlen gekoppelt sind. Diese Harze können direkt für die Adsorption von Verbindungen mit einer Affinität für die bestimmte immobilisierte Aminosäure verwendet werden, oder sie können als funktionalisierte Linker dienen und durch ihren freien Carboxyterminus die kovalente Bindung an einen Liganden mit einem freien primären Amin ermöglichen.
Avidin-/Biotin-Matrizen
Das Protein Avidin weist eine besonders hohe Affinität für den Cofactor Biotin auf (Kd 10–15 M). Diese Eigenschaft stellt ein einzigartiges und leistungsstarkes Instrument dar, das zum Trennen und Aufreinigen eingesetzt werden kann. Viele Verbindungen werden leicht biotinyliert, mit einer Beibehaltung der biologischen Aktivität, wodurch ein breites Spektrum von Trennungsanwendungen ermöglicht wird. Unser Angebot umfasst ein breites Spektrum von biotinylierten Produkten, Biotinylierungsreagenzien und Avidinderivaten.
Ein Nachteil der starken Wechselwirkung zwischen Avidin und Biotin sind die harschen Denaturierungsbedingungen, die zum Erreichen der Dissoziation erforderlich sind. Harsche Bedingungen können durch die Verwendung eines Biotinderivats wie 2-Iminobiotin, das sich unter milderen Bedingungen von Avidin abspaltet, vermieden werden. Eine weitere Alternative ist die Verwendung von monomerem Avidin, das eine deutlich geringere Affinität für Biotin aufweist als das natürliche Tetramer. Dies ermöglicht die Dissoziation des Komplexes durch kompetitive Verdrängung.
Kohlenhydratbindungsmatrizen
Lektine sind Proteine, die an Zuckereinheiten binden und Zellen agglutinieren können. Sobald sie immobilisiert sind, können Lektine für die Aufreinigung von ausgewählten Glykokonjugaten, die allgemein durch kompetitive Verdrängung mit einem hemmenden Einfachzucker zurückgewonnen werden können, eingesetzt werden. Lektinharze werden wie folgt verwendet:
- Zur Aufreinigung von Polysacchariden
- Zum Fraktionieren von Zellteilen
- Zum Aufreinigen von Glykoproteinen und anderen Glykokonjugatmolekülen
- Zum Entfernen von kohlenhydrathaltigen Verunreinigungen aus einer Proteinlösung
Kohlenhydratmatrizen
Immobilisierte Zucker und Zuckerderivate bieten ein wirksames Mittel zum Aufreinigen von verschiedenen Proteinen, die Kohlenhydrateinheiten erkennen und binden. Zu den häufigsten Anwendungen dieser Matrizen zählen die Aufreinigung von Lektinen, Glykosidasen und gegen Kohlenhydrate gerichteten Antikörpern. Die Lektinisolation ist von besonderem Interesse, da sie in hohem Maß nützlich für Studien der Zellmembranstruktur und -funktion, die Bestimmung von Blutgruppen, die Zellfraktionierung und die Stimulation der Lymphozytenmitose sind.
Farbstoff-Ligand-Harze
Die Farbstoff-Ligand-Chromatografie ist eine Affinitätschromatografie, die kovalent gebundenen Textilfarbstoff (reaktive Farbstoffe) zum Aufreinigen von Proteinen einsetzt. Diese Farbstoffe ähneln natürlichen Substraten für die Proteine eine Affinität aufweisen. Daher wird die Farbstoff-Ligand-Chromatografie manchmal auch Pseudo-Affinitätschromatografie genannt. Immobilisierte Farbstoffe sind keine spezifischen Adsorptionsmittel, sondern haben vielmehr einen breiten Bindungsbereich für verschiedene Proteine. Nach einer gründlichen Untersuchung der richtigen Bindungs- und Elutionsbedingungen kann ein hohes Maß der Aufreinigung eines Zielproteins erreicht werden, selbst in Gegenwart einer Mischung aus anderen Proteinen.
Glutathionharze
Glutathion ist ein Tri-Peptid, das aus den Aminosäuren Glutaminsäure, Cystein und Glycin besteht. Glutathion und seine Derivate sind sehr nützlich als Liganden in der Affinitätschromatografie für die Isolation von Glutathion benötigenden Enzymen. Dazu zählen entgiftende Enzyme wie: Glutathiontransferase, Glutathionperoxidase und Glyoxalase I. In den letzten Jahren wurden Glutathion-Agaroseharze aufgrund des Vorhandenseins von Glutathiontransferase (GST) als Teil des Fusionsproteins nützlich für die Isolation von Fusionsproteinen. Durch das Kondensieren von GST an rekombinante Proteine können Glutathionharze ein ausgewähltes Zielprotein von anderen Komponenten trennen.
Heparinharze
Heparin ist ein stark sulfatiertes Glykosaminoglykan, das verbreitet als allgemeiner Affinitätsligand zum Einsatz kommt. Sein hoher Sulfatierungsgrad verleiht dem Molekül eine stark saure Natur, wodurch es durch ionische Wechselwirkungen an viele Stoffe binden kann. Außerdem enthält Heparin einzigartige Kohlenhydratsequenzen, die als spezifische Bindungsstellen für einige Proteine agieren. Immobilisiertes Heparin wird zum Aufreinigen von Plasmagerinnungsproteinen, Nukleinsäurenenzymen, Lipasen und anderen Proteinen eingesetzt.
Hydrophobe Wechselwirkungsharze
Die hydrophobe Chromatografie ist eine vielseitige Technik, die zum Trennen und Aufreinigen von Proteinen auf der Grundlage ihrer Hydrophobie eingesetzt wird. Die Säulen laufen in der Regel unter Bedingungen, die eine hydrophobe Wechselwirkung begünstigen, z. B. eine hohe Ionenstärke. Dadurch ist die hydrophobe Chromatografie ein ideales Instrument zum Einsatz nach einer Salzfällung. Unsere hydrophoben Gele sind in drei funktionellen Varianten erhältlich:
- Rein hydrophobe Harze – Diese Gele enthalten Liganden, die durch eine stabile Etherbindung gebunden sind und keine geladenen Regionen.
- Harze mit gemischten Eigenschaften – Diese Gele enthalten Liganden, die durch eine Aminogruppe gebunden sind und in einigen Fällen haben sie eine Ladung.
- Aminoalkylharze – Diese Gele weisen einen hydrophoben Spacer auf, an den andere funktionelle Gruppen gekoppelt werden können.
IMAC-Matrizen
Immobilisierte-Metallionen-Affinitätschromatografie (IMAC) ist der Prozess der Proteintrennung auf der Grundlage der unterschiedlichen Wechselwirkung verschiedener Proteine mit chelatisierten/unlöslich gemachten Metallen. Die Wechselwirkung ist von Folgendem abhängig:
- Die relative Menge und Position bestimmter Aminosäuren in dem Protein (nämlich Histidin, Cystein, Tyrosin und Tryptophan)
- Die Art des verwendeten Metalls
Allgemein können verschiedene Übergangsmetalle an dasselbe Harz chelatisiert und innerhalb davon ausgetauscht werden. Einige chelatbildende Gruppen können jedoch eine bevorzugte Chelation bestimmter Metalle aufweisen. Häufig verwendete Metalle sind: Kupfer, Zink, Eisen und Nickel.
Immunaffinitätsmatrizen
Immobilisierte Antikörper werden als Analyseinstrumente für die quantitative Bestimmung von Antigenen, einschließlich Immunglobuline und Haptene, eingesetzt. Immunpräzipitation gefolgt von SDS-PAGE ist ein Verfahren, das in der Regel zum Bestimmen der Menge und des Vorkommens eines Antigens in einer komplexen Proteinmischung wie einem Zelllysat eingesetzt wird. Zellen können mit verschiedenen immobilisierten Immunochemikalien gemäß Oberflächenantigenen getrennt werden. Antikörperagaroseprodukte werden auch in verschiedenen Anwendungen eingesetzt, einschließlich Immunadsorption, Affinitätschromatografie und als Festphasen-Sekundärantikörper. Aufgrund dieser Vielseitigkeit umfasst unser Angebot eine große Auswahl von Antikörpern und ganzen Seren, die auf 4%ige vernetzte Agarose immobilisiert wurden.
Nukleotid-/Coenzym-Matrizen
Cofaktoren, Coenzyme und Substrate, die an Matrizen gebunden sind, spielen eine wichtige Rolle bei der Proteinaufreinigung. Da fast ein Drittel der bekannten Enzyme ein Nukleotid-Coenzym benötigt, sind nukleotidgebundene Harze nützlich für die Aufreinigung vieler Proteine. Die Proteinbindung an ein Nukleotid-Coenzym hängt von der Länge des Spacer-Arms und der Position der Ligandenbindung ab. Unser Angebot umfasst verschiedene Nukleotidharze mit verschiedenen Bindungspositionen und Spacer-Armen, um Chemikern mehr Flexibilität bei der Affinitätsfraktionierung zu bieten.
Protein-A-/Protein-G-Matrizen
Protein A und Protein G sind bakterielle Proteine, die spezifisch an die Fc-Region (nicht-antigenbindend) vieler Klassen von Immunglobulinen binden. Protein-A- und -G-Affinitätsmatrizen werden primär für Folgendes eingesetzt:
- Affinitätsaufreinigung von Immunglobulin, primär IgG
- Trennung von Fc von Fab-Fragmenten
Protein-A-Harze waren historisch für die meisten potenziellen Anwendungen beliebt. Es wurde jedoch aufgezeigt, dass Protein-G-Harz das Anwendungsspektrum verbessern und erweitern kann. Die Bindungseigenschaften der zwei Proteine für verschieden Arten von Immunglobulinen unterscheiden sich und können vorteilhaft eingesetzt werden. Einige der Hauptunterschiede bei der Bindung sind:
- Protein A
- Breite Speziesreaktivität; bindet gut an IgG von Mensch, Kaninchen, Rind und Meerschweinchen
- Schwache Bindung an monoklonale Antikörper
- Protein G
- Breitere Speziesreaktivität; deutliche stärkere Bindung an IgG von Maus, Ratte und Ziege
- Stärkere Bindung an monoklonale Antikörper
Literatur
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