Proces purifikace plazmidové DNA

Plasmidová DNA (pDNA) je základní součástí a klíčovou technologií pro výrobu virových vektorů, mRNA a vakcín. Dalekosáhlý potenciál nových terapeutických modalit a vakcín, které se opírají o pDNA, zvyšuje poptávku a potřebu zdokonalených výrobních strategií.

• Přehled výrobního procesu plazmidové DNA
• Obecný proces výroby pDNA
• Výzvy při výrobě pDNA
• Návrh procesu následného čištění plazmidové DNA
• Související produkty

Přehled procesu výroby plazmidové DNA

Výchozí materiál pro purifikaci pDNA po lýze je složitý, přičemž pDNA představuje pouze 3 % obsahu, zatímco zbylých 97 % představují nečistoty. výroba pDNA představuje několik výzev. Naše webové stránky o následném čištění plasmidové DNA poskytují návod, který vám pomůže vybrat správné technologie, které minimalizují problémy s pDNA a zefektivní výrobu plasmidové DNA. 

Obecný postup výroby pDNA

Schémata výroby pDNA byla poprvé vyvinuta v polovině 80. let 20. století a od té doby se opírají o zavedené výrobní procesy, obvykle fermentaci s použitím mikrobiálního zdroje, obvykle E. coli.

Vývoj procesů pro výrobu pDNA zahrnuje následující kroky:

Sběr buněk, buněčná lýza, čiření

Sběr buněk: Po fermentaci se bakterie sbírají centrifugací nebo mikrofiltrací s tangenciálním průtokem (MF-TFF).

Lýza buněk: Krokem lýzy se bakterie rozdělí a uvolní se buněčný obsah včetně plasmidové DNA a kontaminanty včetně genomové DNA, proteinů, RNA a zbytků buněk. Prvním krokem při výrobě pDNA je odstranění těchto kontaminantů pomocí metodik, jako je srážení a flokulace.

Klarifikace: Klarifikace odstraňuje pevný obsah vzniklý během chemické lýzy a neutralizace.

• Technický článek: Článek 3: Sběr, lýza, neutralizace a čištění plazmidové DNA (pDNA) pro aplikace mRNA, DNA vakcín na bázi plazmidů a virových vektorů

Chromatografie (1-2 kroky)

Chromatografie: Chromatografie s výměnou aniontů (AEX) a chromatografie s hydrofobními interakcemi (HIC) jsou nejpoužívanější chromatografické technologie pro purifikaci plazmidů. Jako poslední chromatografický krok lze použít chromatografii s vyloučením velikosti.

• Technický článek: Chromatografické čištění plazmidové DNA (pDNA) pro mRNA, DNA na bázi plazmidů

Ultrafiltrace/diafiltrace (UF/DF)

Ultrafiltrace/diafiltrace: Tangenciální průtoková filtrace odděluje, koncentruje, promývá a přenáší plazmidovou DNA do kompatibilního pufru pro další kroky.

• Technický článek: Technický článek: Ultrafiltrace/diafiltrace (UF/DF) při výrobě plazmidové DNA

Konečná sterilní filtrace

Závěrečná sterilní filtrace: Závěrečná sterilní filtrace odstraňuje mikrobiální kontaminanty, které mohly být zaneseny během zpracování. 

• Technický článek: Provoz filtrační jednotky sterilizačního stupně pro procesy s plazmidovou DNA

Konečný objem pDNA musí splňovat specifikace kvality stanovené regulačními orgány.

Výzvy při výrobě plazmidové DNA

S rostoucí poptávkou po pDNA při výrobě virových vektorů, mRNA a vakcinačních terapií je třeba zvýšit produktivitu v předchozím kroku, aby bylo možné dosáhnout výtěžnosti a účinnosti, zajistit důkladné odstranění nečistot a maximalizovat výtěžnost v následném kroku. Výchozí materiál pro purifikaci pDNA je složitý, přičemž pDNA představuje pouze 3 % obsahu, zatímco zbylých 97 % představují nečistoty. Výroba pDNA tak představuje několik výzev.

Plasmidy jsou velké a negativně nabité

Produkce trpí nízkou produktivitou mikrobiální fermentace a proces čištění komplikuje skutečnost, že plazmidy jsou obecně velké a vysoce negativně nabité. Bakteriální lyzát obsahuje kontaminanty s podobnými vlastnostmi jako pDNA. Většina nečistot je záporně nabitá (RNA, genomová DNA, endotoxiny), má podobnou velikost (otevřená kruhová pDNA, genomová DNA, vysokomolekulární RNA) a je hydrofobní (endotoxiny). Tyto podobnosti mohou vést k separaci s nízkým rozlišením.

Bakteriální lyzáty jsou vysoce viskózní

Bakteriální lyzát může být vysoce viskózní. Pro chromatografii je nutná nízká průtoková rychlost a v závěrečném kroku tangenciální průtokové filtrace (TFF) může být obtížné dosáhnout požadovaných koncentrací.

Plasmidy jsou citlivé na mechanické poškození

pDNA je citlivá na mechanické poškození, které může vést ke změnám její topologické formy. Mezi izoformy plazmidů patří superzávit (zcela neporušený a navinutý kolem sebe), otevřený kruhový (jedno vlákno je přerušeno a molekula se uvolní) a lineární (obě vlákna jsou přerušena s volnými konci). Superzavinuté plazmidy jsou považovány za terapeuticky nejvýznamnější a regulační orgány stanovují požadavky na čistotu superzavinuté formy v konečné léčivé látce pro vakcíny DNA.

Navržení procesu následného čištění plazmidové DNA

Naše kniha o následném čištění plazmidové DNA vám poskytne návod k výběru správných produktů a chemikálií pro optimalizaci a zefektivnění vývoje vašeho následného procesu zpracování plazmidové DNA. Zkoumáme operace buněčného sběru, lýzy, neutralizace a čištění, chromatografického čištění, filtrace tangenciálním průtokem (TFF) a sterilní filtrační jednotky.

Tento průvodce také obsahuje údaje z naší spolupráce s biotechnologickou společností zaměřenou na návrh a vývoj léčiv a produktů na bázi RNA, které vám mohou pomoci orientovat se v procesu výběru produktů.

Zjistěte více o Emprove^® programu, který vám pomůže udržet shodu s aktuálními pravidly správné výrobní praxe.