Příprava a barvení 3D tištěných tkání a skeletů

Úvod

Třírozměrný (3D) tisk biologických tkání se rychle stává nedílnou součástí tkáňového inženýrství. Díky pokroku v technologii 3D tisku je nyní možné používat řadu nových výrobních metod, které umožňují výrobu konstrukcí s buněčnou náplní,^1-2 kompozitních tkání² a také tkání bez scaffoldu³. Tyto pokroky nás posouvají o krok blíže k tisku celých funkčních orgánů ze surovin. Pomocí 3D tisku lze také vytvářet scaffoldy tkáňového inženýrství, které napodobují 3D mikroprostředí nativního orgánu. Pro výrobu tkáňových scaffoldů je 3D tisk vhodný pro širokou škálu biomateriálů, jako je fosforečnan vápenatý, ⁴ CaSiO₃,⁵ kolagen,⁴ hydrogel,⁶ hydroxyapatit,^7-8 polykaprolakton (PCL),^2,8 a také polymery na bázi škrobu.⁹ Tato flexibilita umožňuje výrobu kompozitních struktur, které nejlépe napodobují fyziologické podmínky v okolí tkáně, včetně topografických znaků i mechanických vlastností.¹⁰ Díky těmto vlastnostem slouží 3D tištěné scaffoldy jako žádoucí podpůrné struktury pro 3D kultivaci buněk.

Na druhou stranu charakterizace 3D tištěné tkáně často zahrnuje přípravné kroky, které se při konvenční analýze 2D tkáňových kultur nepoužívají. Například zobrazování skrz tlustou 3D tkáň pomocí technik světelné mikroskopie, jako je konfokální mikroskopie, je náročné kvůli rozptýlenému světlu v biologických vzorcích. Z tohoto důvodu se mnoho zobrazovacích přístupů používá pro řezy tkání o tloušťce menší než 20 µm.¹¹ Ačkoli inovativní zobrazovací přístupy hlásí úspěšnou vizualizaci mnohem silnějších tkání, stále jsou omezeny na tloušťku tkáně maximálně několik milimetrů.¹¹ Proto je pro charakterizaci vícevrstvých buněčných konstruktů vyrobených 3D tiskem důležité správné řezání. Biologická barviva by měla být pečlivě vybrána, aby bylo možné získat co nejvíce relevantních informací o vytištěné tkáni, jako je životaschopnost a zrání buněk. Důležité je například stanovení životaschopnosti buněk ve vnitřním jádru 3D tištěného konstruktu, protože u těchto buněk může být větší pravděpodobnost nekrózy v důsledku nedostatečné výměny živin.¹² V tomto technologickém přehledu stručně diskutujeme o zpracování a barvicích přístupech pro hodnocení 3D tištěných tkání a scaffoldů.

Potvrzení kompatibility materiálu se zájmovými buňkami

Před optimalizací techniky 3D tisku pro konkrétní biologickou aplikaci může být výhodné potvrdit kompatibilitu materiálu se zájmovými buňkami, aby se zajistilo, že se buňky na vytištěném materiálu uchytí a rozmnoží. Za tímto účelem lze provést testy životaschopnosti a proliferace buněk kultivovaných na surovém materiálu. 

Příprava 3D tištěné tkáně/skeletu pro světelnou mikroskopii

Po úspěšném vytištění buněčného konstruktu nebo jeho vypěstování na skeletu se před vložením a řezáním použije chemické fixační činidlo (Tabulka 1), aby se zabránilo změně nebo ztrátě buněčných složek během zpracování. Pokud není chemická fixace žádoucí, lze tkáň alternativně zmrazit a provést kryořezy. Ačkoli je použití roztoku formalínu při fixaci tkáně oblíbené,¹³ volba fixačního prostředku do značné míry závisí na specifických vlastnostech tkáně a účelu studie. Mezi faktory, které mohou ovlivnit fixaci, patří mechanismus fixativa (např. zesíťování, denaturace atd.) ¹³ a také podmínky fixačního postupu (např. teplota a doba působení fixativa na tkáň).^13-14 Pro fixaci tkání jsou k dispozici také netoxická činidla, která neobsahují formaldehyd nebo glutaraldehyd (HistoChoice^® tkáňové fixační činidlo (č. výrobku: Sial/H2904); (č. výrobku: Sial/H2904); (č. výrobku: Sial/H2904); (č. H2904) a čistící prostředek (č. výrobku. H2779). Úplný seznam výrobků pro zpracování tkání naleznete zde.

Tabulka 1. Různá fixativa používaná k fixaci tkání.

Po správné fixaci lze tkáň postupně dehydratovat v etanolu (Číslo výrobku: 2). E7023) a vložit do média, jako je Paraplast^® (Tabulka 2), pro řezání.¹³ Zapuštěnou tkáň lze pomocí mikrotomu rozřezat v požadované tloušťce na skleněná sklíčka (Tabulka 2). Tloušťka řezu by měla být stanovena na základě konkrétního typu vytištěné tkáně a také biologických barviv, která budou použita. Zatímco například svalové tkáně lze řezat na 4-6 µm plátky, vzorky mozku nebo míchy se doporučuje řezat na silnější (10-40 µm) plátky.¹⁵

Tabulka 2. Materiály použité pro zpracování a vložení vzorků tkání.

Po rozřezání tkáně na mikroskopická sklíčka lze provést různá barvení pomocí barviv a pufrů uvedených v Tabulce 3. Pro specifický antigen, který vás zajímá, lze použít techniky imunohistochemie (IHC). Další informace o IHC získáte kliknutím na tento odkaz. Po provedení IHC se vzorky často barví společně s protibarvivem, jako je například DAPI  (produkt č. 1). D9542) nebo hematoxylin (č. výrobku SIGMA/HHS16)(č. výrobku SIGMA/HHS16). HHS16).

Tabulka 3. Oblíbená biologická barviva a pufry

Zobrazení 3D tištěné tkáně/pasti pomocí rastrovací elektronové mikroskopie (SEM)

Kromě výše popsaných technik světelné mikroskopie může být k vizualizaci morfologie 3D tištěné konstrukce v nanorozměrech nezbytná analýza SEM. Zobrazování pomocí SEM je zvláště užitečné u 3D tištěných scaffoldů, které jsou navrženy tak, aby napodobovaly mikro/nanostruktury tkáňového mikroprostředí. Příprava biologických vzorků pro SEM zahrnuje fixaci ve fixačních prostředcích třídy EM (Tabulka 4), postupnou dehydrataci v etanolu  (produkt č. 3), dehydrataci v etanolu  (produkt č. 4) a dehydrataci v etanolu. E7023), sušení v kritickém bodě a potažení vodivým materiálem (např. zlatem) pro snížení artefaktů při nabíjení.

Tabulka 4. Chemikálie použité k fixaci a dehydrataci pro přípravu snímků SEM

Odkazy

1. Kolesky DB, Truby RL, Gladman AS, Busbee TA, Homan KA, Lewis JA. 2014. 3D Bioprinting of Vascularized, Heterogeneous Cell-Laden Tissue Constructs. Adv. Mater.. 26(19):3124-3130. https://doi.org/10.1002/adma.201305506

2. Lee J, Hong JM, Jung JW, Shim J, Oh J, Cho D. 3D printing of composite tissue with complex shape applied to ear regeneration. Biofabrication. 6(2):024103. https://doi.org/10.1088/1758-5082/6/2/024103

3. Norotte C, Marga FS, Niklason LE, Forgacs G. 2009. Scaffold-free vascular tissue engineering using bioprinting. Biomaterials. 30(30):5910-5917. https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2009.06.034

4. Inzana JA, Olvera D, Fuller SM, Kelly JP, Graeve OA, Schwarz EM, Kates SL, Awad HA. 2014. 3D printing of composite calcium phosphate and collagen scaffolds for bone regeneration. Biomaterials. 35(13):4026-4034. https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2014.01.064

5. Wu C, Fan W, Zhou Y, Luo Y, Gelinsky M, Chang J, Xiao Y. 2012. 3D-printing of highly uniform CaSiO3 ceramic scaffolds: preparation, characterization and in vivo osteogenesis. J. Mater. Chem.. 22(24):12288. https://doi.org/10.1039/c2jm30566f

6. Hockaday LA, Kang KH, Colangelo NW, Cheung PYC, Duan B, Malone E, Wu J, Girardi LN, Bonassar LJ, Lipson H, et al. 2012. Rapid 3D printing of anatomically accurate and mechanically heterogeneous aortic valve hydrogel scaffolds. Biofabrication. 4(3):035005. https://doi.org/10.1088/1758-5082/4/3/035005

7. Leukers B, Gülkan H, Irsen SH, Milz S, Tille C, Schieker M, Seitz H. 2005. Hydroxyapatite scaffolds for bone tissue engineering made by 3D printing. J Mater Sci: Mater Med. 16(12):1121-1124. https://doi.org/10.1007/s10856-005-4716-5

8. Park SA, Lee SH, Kim WD. 2011. Fabrication of porous polycaprolactone/hydroxyapatite (PCL/HA) blend scaffolds using a 3D plotting system for bone tissue engineering. Bioprocess Biosyst Eng. 34(4):505-513. https://doi.org/10.1007/s00449-010-0499-2

9. Lam C, Mo X, Teoh S, Hutmacher D. 2002. Scaffold development using 3D printing with a starch-based polymer. Materials Science and Engineering: C. 20(1-2):49-56. https://doi.org/10.1016/s0928-4931(02)00012-7

10. Murphy SV, Atala A. 2014. 3D bioprinting of tissues and organs. Nat Biotechnol. 32(8):773-785. https://doi.org/10.1038/nbt.2958

11. Gantenbein-Ritter B, Sprecher CM, Chan S, Illien-Jünger S, Grad S. 2011. Confocal Imaging Protocols for Live/Dead Staining in Three-Dimensional Carriers.127-140. https://doi.org/10.1007/978-1-61779-108-6_14

12. Griffith CK, Miller C, Sainson RC, Calvert JW, Jeon NL, Hughes CC, George SC. 2005. Diffusion Limits of an in Vitro Thick Prevascularized Tissue. Tissue Engineering. 11(1-2):257-266. https://doi.org/10.1089/ten.2005.11.257

13. Howat WJ, Wilson BA. 2014. Tissue fixation and the effect of molecular fixatives on downstream staining procedures. Methods. 70(1):12-19. https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2014.01.022

14. Zeller R. 1989. Fixation, Embedding, and Sectioning of Tissues, Embryos, and Single Cells. Current Protocols in Molecular Biology. 7(1): https://doi.org/10.1002/0471142727.mb0101s07

15. Chen X, Cho D, Yang P. 2010. Double staining immunohistochemistry. N Am J Med Sci.. 2(5):241–245. https://dx.doi.org/10.4297%2Fnajms.2010.2241