Průběh testu migrace a invaze buněk pomocí vložek pro buněčné kultury Millicell^®

• Přehled testů migrace a invaze
• Co potřebuji k provedení testu migrace/invaze buněk?
• Výběr správné velikosti pórů pro můj test buněčné migrace/invaze
• Optimalizace testu migrace a invaze
• Protokol vzorku testu migrace a invaze
• Data ze vzorku testu migrace a invaze
• Tipy a triky k testu migrace a invaze
• Tabulka produktů
• Reference

Přehled testů migrace a invaze

Migrace buněk je cílený pohyb buněk v reakci na chemický (např. chemoatraktant) nebo mechanický podnět. Je to důležitá vlastnost buněk, která je kritická pro jejich vývoj a normální procesy, jako je hojení ran. Podílí se však také na chorobných stavech, jako je zánět nebo migrace a invaze nádorových buněk.¹ Testy migrace a invaze se v buněčné biologii již dlouho využívají ke studiu metastáz nádorů, přičemž nejběžnější testy jsou založeny na systému Boydenova testu. Tento systém poprvé použil Dr. Boyden v roce 1962, kdy demonstroval použití porézní membrány Millipore^® pro chemotaxi.²

Dnes lze migrační testy provádět pomocí vložek pro buněčné kultury Millicell^® visící na základě tohoto Boydenova testovacího systému, zatímco invazní testy vyžadují potažení membrány ECM gelem, například Matrigel^®, a následné nasazení buněk na ni. Tento povlak působí jako bariéra, kterou buňky při invazi pronikají. K dispozici jsou vložky s různou velikostí pórů v závislosti na velikosti používaných buněk.

Systém Boyden Chamber využívá dutou plastovou komoru a na jednom konci je uzavřen porézní membránou. Tato komora je pak zavěšena nad větší jamkou, která může obsahovat médium a/nebo chemoatraktanty. Buňky se před přidáním na apikální (horní) stranu membrány ve vložkách promyjí v médiu bez séra, aby se zajistilo odstranění veškerého séra. Médium obsahující příslušný chemoatraktant (např, Fetální hovězí sérum, různé cytokiny atd.) se přidá do jamek pod vložkami (spolu s negativní kontrolou, kde není v médiu žádný chemoatraktant) a buňky se ponechají v inkubátoru při teplotě 37 °C CO₂ po požadovanou dobu.

Po této inkubaci se nemigrované buňky opatrně odstraní z apikální strany membrány a migrované buňky na bazolaterální straně membrány lze kvantifikovat pomocí barvení a zobrazování buněk.

Obrázek 1. Princip invazivního testu. Buňky se nasadí do vložek potažených ECM na apikální stranu membrány, zatímco se do destičky s buněčnou kulturou přidá médium obsahující příslušný chemoatraktant. Destičky se ponechají po požadovanou dobu (např. 24 hodin), aby se umožnila invaze buněk na bazolaterální stranu membrány. Neinvadované buňky se odstraní vatovým tamponem a invadované buňky se před zobrazením a počítáním fixují a obarví. Pro migrační testy stačí vynechat krok potažení ECM.

Co potřebuji k provedení migračního/invazního testu?

• Millicell^® vložky pro buněčné kultury (viz výběr vložek níže)
• Extracelulární matrix (např.g. Corning^® Matrigel^® Bazická membránová matrice)
• Destičky pro tkáňové kultury
• Buněčné linie
• Média pro buněčné kultury
• Chemoatraktanty (např.g., Fetální hovězí sérum)
• Fixační roztok (např. 70% ethanol nebo 4% paraformaldehyd)
• Sterilní kleště
• Bavlněné tampony
• Podpůrný roztok (např, Crystal Violet nebo DAPI)
• Sterilní voda

Výběr správné velikosti pórů pro můj test migrace/invaze buněk

Velikost pórů vložky závisí na typu buněk, které se mají v testu použít. Je důležité, aby pro menší typy buněk nebyla použita příliš velká velikost pórů, ale póry nesmí být tak malé, aby se jimi migrující buňky neprotáhly ani v přítomnosti chemoatraktantu. V tabulce 1 jsou na základě literatury uvedena doporučení pro velikost membránových pórů pro vybrané typy migrujících a invazivních buněk. 

Tabulka 1. Velikost pórů membrán buněčných kultur a doprovodné testy.

Aplikace	Typ buňky/b>	Velikost pórů (µm)
Migrace/b> Migrace buněk po chemotaxi Migrace buněk po haptotaxi Test s Boydenovou komorou	Endoteliální3-4,8, HUVEC6-7./sup>, HMVEC5-6	3.0, 8.0
	Neutrofily<.sup>9-12, PMNs12	3.0
	Lymfocyty9,13, makrofágy14-15, monocyty16-17	3.0, 5.0
	Neuronální buňky18,19	3.0
	Připojení k buňkám.Dendritické buňky17,20-22	3.0, 5.0, 8.0
	Epiteliální fibroblasty23-25	3.0, 8.0
	Leukocyty12,13,26,27	3.0, 5.0
	Hladká svalovina28-30	8.0
		< Melanom31-33	8.0
		Gliom Lymfom.34-36, Jurkat38	8.0
		Osteoblasty39,41-43	5.0, 8.0
Rakovina prsu37,40		8.0
Endoteliální40,44-49	3.0, 8,0

Závěsné vložky pro buněčné kultury Millicell^® mají několik možností kompatibilních s testy migrace a invaze (viz tabulka 2). Všechny vložky jsou baleny jednotlivě v blistrech a hodí se na standardní destičky pro tkáňové kultury.    

Tabulka 2. Millicell^® vložky pro buněčné kultury pro testy migrace a invaze. Membrána PET je ošetřena tkáňovou kulturou, která podporuje uchycení a růst buněk.

Podrobné vysvětlení.Popis	Membránová plocha	Optická vlastnost	Velikost póru	Hustota pórů (póry/cm2)	Kat. Č. (48/ks)
Vložky do 24 jamek Millicell®	0.3 cm2	Průsvitné	3,0 µm 5,0 µm 8.0 µm	2 × 106 6 × 10.5 2 × 105	PTSP24H48 PTMP24H48 PTEP24H48
Millicell® 12jamkové vložky	1.1 cm2	Průhledné	3.0 µm 5,0 µm 8.0 µm	2 × 106 6 × 10.5 2 × 105	PTSP12H48 PTMP12H48 PTEP12H48
Millicell® 6jamkové vložky	4.5 cm2	Průsvitné	3.0 µm 5.0 µm 8.0 µm	2 × 106 6 × 10.5 2 × 105	PTSP06H48 PTMP06H48 PTEP06H48

Optimalizace migračního a invazního testu

1. Vložení výběru:
2. Hustota výsevu buněk: Viz "Výběr vložky Millicell^® Cell Culture Insert pro migrační a invazní testy" v části výše.
3. Hustota výsevu buněk: Je důležité optimalizovat hustotu výsevu pro vaši konkrétní buněčnou linii. Při příliš vysoké koncentraci se buňky budou špatně počítat nebo by mohly přesytit póry v membráně. Příliš malý počet přidaných buněk by mohl vést k nekonzistentnímu počítání a výsledkům.
4. Koncentrace hemoatraktantu: Optimalizace chemoatraktantu, který vás zajímá, je důležitým krokem, zejména pokud neexistují žádné dříve publikované údaje o interakci mezi buněčnou linií, kterou používáte, a chemoatraktantem. V takovém případě může být dobré provést test s několika různými sériovými ředěními chemoatraktantu. Reakce různých typů buněk se může lišit v závislosti na použitém chemoatraktantu. U dobře prozkoumaných chemoatraktantů, jako je FBS, je pro začátek vhodná koncentrace 10 % séra, zatímco optimalizujete hustotu výsevu.
5. Časování: Je důležité optimalizovat dobu inkubace pro vaše migrační testy, protože nejvhodnější doba inkubace závisí na typu buněk a použitém chemoatraktantu (obvykle je dobrým výchozím bodem 16-24 hodin, ale některé buněčné linie mohou potřebovat více času).
6. Barvení a počítání buněk: Existuje několik různých metod barvení, které lze použít, když chcete zobrazit a spočítat vaše migrované buňky. Patří mezi ně krystalová violeť (barvení celých buněk) a barvení DAPI (barvení buněčných jader). Po fixaci a obarvení lze buňky vizualizovat a kvantifikovat pomocí inverzního mikroskopu.
7. Objem média: Vložky pro závěsné buněčné kultury Millicell^® jsou kompatibilní s většinou destiček pro tkáňové kultury. Vzhledem k tomu, že rozměry jamek se mohou u různých značek mírně lišit, je nejlepším postupem optimalizovat množství média v jamce tak, aby dosáhlo stejné úrovně jako médium v samotné vložce. Pro 24jamkové formáty je dobrým výchozím bodem 100 µl ve vložce a 600 µl v jamce nebo 200 µl ve vložce a 900 µl v jamce.

Migration and Invasion Assay Sample Protocol - Optimization of Seeding Density

Materiály:

• Vysoce migrující / invazivní buněčná linie, např, HT 1080 buněk
• Vysoce migrující buněčná linie, např. buňky NIH 3T3
• Nízce migrující buněčná linie, např, MCF-7 buňky
• Millicell^® Vložky pro buněčné kultury, 8 μM PET, 24jamkové
• Corning^® Costar^® 24jamkové destičky
• Greiner 75 cm² baňky na tkáňové kultury
• Roztok tripsinu-EDTA
• EDTA 0.02% roztok v D-PBS
• Corning^® Matrigel
sup>® Matrix bazální membrány se sníženým obsahem růstových faktorů (GFR)
• Potahovací pufr
  • 0.01M Tris (pH 8,0)
  • 0.7% NaCl

• HT 1080 & MCF-7 aplikační médium / kontrolní médium (bez séra)
  o   EM
  o   50 jednotek penicilinu / 50 µg/ml streptomycinu
  o   2 mM L-glutamin
  o   Nezbytné aminokyseliny

• HT 1080 & kultivační médium MCF-7 / basolaterální testovací médium (10% FBS)
  o   EM
  o   50 jednotek penicilinu / 50 µg/ml streptomycinu
  o   2 mM L-glutamin
  o   Nezbytné aminokyseliny
  o   10% FBS

• NIH 3T3<.b> kultivační médium (10% telecí sérum)
  o   DMEM
  o   50 jednotek penicilinu / 50 µg/ml streptomycinu
  o   2 mM L-glutamin
  o   10% telecí sérum

• NIH 3T3<.b> apikální médium/kontrolní médium (bez séra)
  o   DMEM
  o   50 jednotek penicilinu / 50 µg/ml streptomycinu
  o   2 mM L-glutamin

• NIH 3T3<.b> bazální testovací médium (10% FBS)
  o   DMEM
  o   50 jednotek penicilinu / 50 µg/ml streptomycinu
  o   2 mM L-glutamin
  o   10% FBS

Protokol potahování pro invazivní testy

1. Alikvotujte a skladujte Matrigel^® při -20 °C. Rozmrazte alikvot na ledu nebo při 4 °C.
2. Připravte potahovací roztok zředěním Matrigela vychlazeným potahovacím pufrem na konečnou koncentraci 200 µg/ml. Jemně promíchejte a uchovávejte na ledu až do dalšího použití.
   • Tip:
3. Sterilními kleštěmi umístěte požadovaný počet závěsných destiček Millicell^® do 24jamkových destiček pro tkáňové kultury.
4. Pipetou opatrně naneste 100 l potahovacího roztoku do středu apikální strany destiček a bez protřepávání inkubujte uzavřenou destičku při 37 °C po dobu 2-3 hodin. Jakmile tak učiníte, ujistěte se, že další kroky následují rychle, aby nedošlo k vyschnutí gelu.

Den 1: Osazení vložek buněčných kultur buňkami

1. Buňky byly odděleny z baněk buněčných kultur a resuspendovány v kultivačním médiu obsahujícím sérum k neutralizaci trypsinu. 
2. Buňky byly dvakrát promyty v médiu bez séra, aby bylo zajištěno odstranění veškerého séra.
3. Buněčná suspenze byla spočítána a sériově naředěna na požadované koncentrace v médiu bez séra.
4. S pomocí sterilní pinzety byly vložky buněčných kultur vyjmuty z obalu a umístěny do jamek kultivačních desek. Tento postup se opakoval, dokud vložky neobsahoval požadovaný počet jamek.
Pro invazivní testy použijte vložky buněčných kultur potažené ECM, jak je popsáno výše.
5. Buňky byly nasazeny na vnitřní stranu vložky, na apikální stranu membrány (100 µl každé buněčné suspenze). 
6. 600 µl testovacího média bylo přidáno na bazolaterální stranu každé vložky v jamkách. Toto médium obsahovalo 10 % FBS jako chemoatraktant pro testované vzorky v polovině destičky, zatímco v druhé polovině destičky bylo jako kontrola použito médium bez séra. Pro každou hustotu výsevu byly použity tři opakování pro média s FBS a bez FBS.  Jako slepá kontrola byla zařazena vložka bez buněk. Nasazené destičky byly umístěny do humifikovaného inkubátoru při 37 °C, 5 % CO₂ na 24 hodin.

Den 2: Hodnocení migrovaných buněk

1. Z jamek 24jamkové destičky bylo odstraněno médium. 
2. Pomocí vatového tamponu navlhčeného v médiu byly opatrně odstraněny zbývající buňky, které nemigrovaly z apikální strany membrány ve vložce. To se provádělo opatrným několikerým otáčením navlhčeného vatového tamponu kolem vložky ve směru a proti směru hodinových ručiček. Je velmi důležité, abyste zde dávali pozor a nepoškodili membránu.
3. Buňky byly fixovány ve 4% paraformaldehydu po dobu 10 minut a poté dvakrát promyty PBS.
4. Buňky byly permeabilizovány v 0,1% Tritonu X-100 po dobu 10 min před dvojím promytím v PBS.
5. Buňky byly poté obarveny 1 µM roztokem DAPI po dobu 15 min a jednou promyty v PBS.
6. 900 µl vody molekulární kvality bylo přidáno do jamky 24jamkové destičky a 200 µl na apikální stranu vložky v rámci 24jamkové destičky.  
7. Vložky byly zobrazeny přímo z 24jamkové destičky na filtru DAPI pomocí 10x objektivu. Je důležité, aby nastavení obrazu bylo u jednotlivých vzorků konzistentní. 
8. Snímky byly pořízeny a migrované buňky byly spočítány ve čtyřech zorných polích pro každý insert.
9. Bylo také doplněno podchycení 0,5% krystalovou violetí. Před zobrazením bylo do jamky 24jamkové destičky přidáno 900 µl PBS a na apikální stranu vložky v rámci 24jamkové destičky 200 µl molekulární vody.

Vzorky lze uložit a v případě potřeby znovu obarvit. Vložky lze uchovávat při teplotě 4 °C ve vodě molekulární kvality.

Obrázek 2. Příklad uspořádání destiček s 24 jamkami pro optimalizaci hustoty výsevu pro testy migrace buněk (nebo testy invaze, pokud se používají destičky potažené materiálem Matrigel^®).

Údaje o migraci vzorků a invazivních testech

Migrační a invazivní testy byly provedeny podle popisu v předchozí části. Po těchto 24hodinových migračních testech bylo provedeno barvení krystalovou violetí, a to pro tři buněčné linie (HT 1080, NIH 3T3 a MCF-7) s 10% FBS a bez něj. To umožnilo zřetelně zobrazit migrující buňky a ukázat úroveň migrace pro každou buněčnou linii za každé podmínky (obrázky jsou uvedeny na obrázku 3). Buňky HT 1080 jsou schopné invaze a migrace, buňky NIH 3T3 jsou schopné migrace pouze za podmínek uvedených v tomto experimentu, zatímco buňky MCF-7 nejsou schopné migrovat přes póry směrem k chemoatraktantu.

Obrázek 3. Barvení krystalovou violetí migrujících buněk (A - HT1080, B - NIH 3T3, C - MCF-7) na bazolaterální straně membrány po 24 hodinách, s 10% FBS a Matrigel^® (200 µg/ml) a bez nich, při různých hustotách výsevu. Reprezentativní snímky jsou zobrazeny z jednoho zorného pole, z jednoho opakování vložky při každé hustotě výsevu. Buněčné linie HT 1080 a NIH 3T3 mohou migrovat póry směrem k chemoatraktantu, zatímco buňky MCF-7 nikoli. Pouze buněčná linie HT 1080 může proniknout přes membránu potaženou materiálem Matrigel^®.

Kromě barvení krystalovou violetí byly buňky také obarveny DAPI, aby bylo možné je zobrazit a spočítat pomocí fluorescenčního mikroskopu (znázorněno na obrázku 4). Zobrazování bylo dokončeno pomocí 10násobného objektivu s filtrem DAPI. Po pořízení snímků bylo možné spočítat migrované/invadované buňky ve čtyřech zorných polích pro každou vložku. DAPI je jaderné barvivo, které umožňuje snadnější počítání migrujících/navštívených buněk, zejména pokud je přítomno velké množství buněk ve vyšších hustotách výsevu.

Obrázek 4. Barvení DAPI migrujících buněk (A - HT1080, B - NIH 3T3, C - MCF-7) na bazolaterální straně membrány po 24 hodinách, s 10% FBS a Matrigel^® (200 µg/ml) a bez nich, při různých hustotách výsevu. Reprezentativní snímky jsou zobrazeny z jednoho zorného pole, z jednoho opakování vložky při každé hustotě výsevu. Buněčné linie HT 1080 a NIH 3T3 mohou migrovat póry směrem k chemoatraktantu, zatímco buňky MCF-7 nikoli. Pouze buněčná linie HT 1080 může proniknout přes membránu potaženou materiálem Matrigel^®.

Cílem tohoto experimentu bylo optimalizovat hustotu výsevu pro testy migrace a invaze s použitím 10% FBS jako chemoatraktantu pro tři různé buněčné linie po 24 hodinách inkubace. Počet buněk, které migrovaly nebo invadovaly v každé vložce, byl vypočítán zprůměrováním počtu buněk ve čtyřech zorných polích po obarvení DAPI a zobrazení. Grafické znázornění výsledků je uvedeno na obrázku 5. Tyto výsledky nám umožnily určit, že optimální hustota výsevu v tomto experimentu je 25 000 buněk na vložku pro migrační i invazní testy. Bylo zjištěno dobré oddělení počtu buněk mezi vložkami, které obsahovaly chemoatraktant (+FBS), a negativní kontrolou (-FBS), přičemž hustota výsevu 25 000 buněk na vložku vykazovala nejlepší poměr signál/šum pro obě migrující buněčné linie (5:1 pro HT 1080 a 6:1 pro NIH 3T3). Pro každou buněčnou linii byly testovány odpovídající kontroly pro porovnání podmínek s FBS a bez FBS (údaje nejsou uvedeny). Vhodná hustota výsevu závisí na konkrétních podmínkách, které má uživatel testovat (např. doba migrace, použitá buněčná linie, použitý chemoatraktant atd.) 

Obrázek 5. Kvantifikace migrovaných buněk na bazolaterální straně membrán po 24 hodinách s 10% FBS a Matrigel^® (200 µg/ml) a bez nich, při různých hustotách výsevu (zobrazuje průměr buněk spočítaných ze čtyř zorných polí, ze tří vložených replikátů). Buněčné linie HT 1080 a NIH 3T3 mohou migrovat póry směrem k chemoatraktantu, zatímco buňky MCF-7 nikoli. Pouze buněčná linie HT 1080 může proniknout přes membránu potaženou materiálem Matrigel^®.

Tipy a triky pro testy migrace a invaze

• Je důležité zahrnout vložky buněčných kultur do médií bez chemoatraktantu jako negativní kontrolu a také identifikovat migraci na pozadí. Kromě toho lze jako další kontrolu použít nemigrující buněčné linie (např. MCF-7).
• Při přípravě buněčných suspenzí dávejte pozor na rozbíjení shluků buněk (jemně pipetujte ručně pipetou s menším otvorem), aby nedošlo ke shlukování buněk uprostřed nebo na okrajích vložky. Vždy používejte zahřáté médium, aby nedošlo k agregaci buněk.
• Ujistěte se, že jsou vložky pro buněčné kultury správně umístěny v jamce destičky pro tkáňové kultury. Existuje několik různých typů destiček, které lze použít se závěsnými vložkami, proto je důležité, aby byly vložky správně usazeny a umožnily rovnoměrnou migraci/invazi. Ujistěte se, že se víčko destičky může správně zavřít, aby se zabránilo odpařování během inkubace (pokud se posunou z místa, můžete po přenosu vložky pro buněčné kultury přesunout na místo pomocí kleští čistou rukou v rukavici.
  
• Ujistěte se, že jste buňky suspendovali v médiu bez séra a před nasazením do jamek je několikrát jemně pipetovali, abyste zabránili jakékoli kontaminaci a omezili shlukování buněk.
• Pro lepší přesnost a výsledky je nezbytné optimalizovat různé parametry, jako je doba trvání invaze, hustota výsevu a koncentrace Matrigela^®, v závislosti na zvoleném experimentu a typu buněk.
• Na začátku lahvičku Matrigela^® alikvotujte, abyste se vyhnuli vícenásobným cyklům zmrazování/rozmrazování. V případě potřeby jednotlivé lahvičky rozmrazte.
• Při pipetování Matrigela^® do každé vložky se pokud možno vyhněte vzduchovým bublinám.
• Před nasazením buněk se ujistěte, že je povlak Matrigela^® rovnoměrně rozložen a ztuhl. K nadzvednutí vložky a vizuální kontrole použijte kleště.
• Při odstraňování nemigrujících/invazivních buněk z apikální strany membrány buďte velmi opatrní. Příliš velký tlak může vést k oddělení membrány nebo může dojít k vytlačení některých migrujících/invadovaných buněk (Obrázek 6).
• Vložky buněčných kultur zvedněte pomocí kleští a poté vložku přeneste do čisté ruky v rukavici, abyste si usnadnili úchop při stírání vložky. Dbejte na to, abyste se při tom nedotýkali samotné membrány.
• Lze použít různé fixační prostředky, například 70% etanol nebo 7% paraformaldehyd. Při použití alkoholu k fixaci buněk v kombinaci s barvením krystalovou violetí zajistěte, abyste snímky a počítání buněk provedli v rozmezí několika dnů, protože buněčné struktury se mohou jevit rozmazané a při příliš dlouhém ponechání je lze hůře spočítat.
• Po obarvení je třeba vložky Millicell^® řádně skladovat, aby nedošlo k vyschnutí a rozmazání snímků.

Obrázek 6. Obarvení vložek Millicell^® krystalovou violetí. A. Na vložku Millicell^® byl při jejím vyjímání vyvíjen příliš velký tlak, což způsobilo odsazení membrány a to, že vložka nebyla při zobrazování ve stejné ohniskové rovině. B. Obarvení vložek Millicell^® krystalovou violetí s použitím etanolu jako fixačního činidla. Při použití etanolu jako fixačního činidla by měly být vzorky zobrazeny co nejdříve, aby nedošlo ke zkreslení morfologie buněk etanolem.

Reference

1 - 20

1. Horwitz R, Webb D. 2003. Cell migration. Current Biology. 13(19):R756-R759. https://doi.org/10.1016/j.cub.2003.09.014

2. Boyden S. 1962. THE CHEMOTACTIC EFFECT OF MIXTURES OF ANTIBODY AND ANTIGEN ON POLYMORPHONUCLEAR LEUCOCYTES. 115(3):453-466. https://doi.org/10.1084/jem.115.3.453

3. Sawamiphak S, Ritter M, Acker-Palmer A. 2010. Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses. Nat Protoc. 5(10):1659-1665. https://doi.org/10.1038/nprot.2010.130

4. Tamari T, Kawar-Jaraisy R, Doppelt O, Giladi B, Sabbah N, Zigdon-Giladi H. The Paracrine Role of Endothelial Cells in Bone Formation via CXCR4/SDF-1 Pathway. Cells. 9(6):1325. https://doi.org/10.3390/cells9061325

5. Hamdollah Zadeh M, Glass CA, Magnussen A, Hancox JC, Bates DO. 2008. VEGF-Mediated Elevated Intracellular Calcium and Angiogenesis in Human Microvascular Endothelial CellsIn Vitroare Inhibited by Dominant Negative TRPC6. Microcirculation. 15(7):605-614. https://doi.org/10.1080/10739680802220323

6. Hadjichristou C, Papachristou E, Bonovolias I, Bakopoulou A. 2020. Three-dimensional tissue engineering-based Dentin/Pulp tissue analogue as advanced biocompatibility evaluation tool of dental restorative materials. Dental Materials. 36(2):229-248. https://doi.org/10.1016/j.dental.2019.11.013

7. DU H, SHI H, CHEN D, ZHOU Y, CHE G. 2015. Cross-talk between endothelial and tumor cells via basic fibroblast growth factor and vascular endothelial growth factor signaling promotes lung cancer growth and angiogenesis. 9(3):1089-1094. https://doi.org/10.3892/ol.2015.2881

8. Matsushita T, Kibayashi T, Katayama T, Yamashita Y, Suzuki S, Kawamata J, Honmou O, Minami M, Shimohama S. 2011. Mesenchymal stem cells transmigrate across brain microvascular endothelial cell monolayers through transiently formed inter-endothelial gaps. Neuroscience Letters. 502(1):41-45. https://doi.org/10.1016/j.neulet.2011.07.021

9. Sanders SP, Proud D. Viral Modulation of airway inflammation. Asthma: Causes and Mechanisms, 4; 1999. 23 p.

10. Horbett TA, Klumb, LA. Cell culturing: surface aspects and considerations. New York, NY: Marcel Dekker, Inc.; 1996. 351-445 p:

11. Kidney JC, Proud D. 2000. Neutrophil Transmigration across Human Airway Epithelial Monolayers. Am J Respir Cell Mol Biol. 23(3):389-395. https://doi.org/10.1165/ajrcmb.23.3.4068

12. Van Oostveldt K, Paape M, Burvenich C. 2002. Apoptosis of Bovine Neutrophils Following Diapedesis Through a Monolayer of Endothelial and Mammary Epithelial Cells. Journal of Dairy Science. 85(1):139-147. https://doi.org/10.3168/jds.s0022-0302(02)74062-9

13. Welch HC, Condliffe AM, Milne LJ, Ferguson GJ, Hill K, Webb LM, Okkenhaug K, Coadwell WJ, Andrews SR, Thelen M, et al. 2005. P-Rex1 Regulates Neutrophil Function. Current Biology. 15(20):1867-1873. https://doi.org/10.1016/j.cub.2005.09.050

14. Heise R, Vetter-Kauczok CS, Skazik C, Czaja K, Marquardt Y, Lue H, Merk HF, Bernhagen J, Baron JM. 2012. Expression and Function of Macrophage Migration Inhibitory Factor in the Pathogenesis of UV-Induced Cutaneous Nonmelanoma Skin Cancer?. 88(5):1157-1164. https://doi.org/10.1111/j.1751-1097.2012.01108.x

15. Wang X, Ma G, Zhang R, Liu L, Zhu J, Zhu H. 2019. Molecular characterization and biological functioning of interleukin-8 in Siberian sturgeon (Acipenser baeri). Fish & Shellfish Immunology. 9091-101. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2019.04.010

16. Cappione A, Chen C, Neville SC, Nadler ST. A comprehensive workflow for screening and real-time analysis of cell migration. SigmaAldrich, 2016:

17. Spary LK, Salimu J, Webber JP, Clayton A, Mason MD, Tabi Z. 2014. Tumor stroma-derived factors skew monocyte to dendritic cell differentiation toward a suppressive CD14⁺PD-L1⁺phenotype in prostate cancer. OncoImmunology. 3(9):e955331. https://doi.org/10.4161/21624011.2014.955331

18. Sokolowski JD, Chabanon-Hicks CN, Han CZ, Heffron DS, Mandell JW. Fractalkine is a â??find-meâ? signal released by neurons undergoing ethanol-induced apoptosis. Front. Cell. Neurosci.. 8 https://doi.org/10.3389/fncel.2014.00360

19. Pruyn SA. Stability and Biodistribution of Endocannabinoids Across the Human Brain Microvascular Endothelium Barrier. Albany College of Pharmacy and Health Sciences; 2019:

20. Tucci M, Ciavarella S, Strippoli S, Brunetti O, Dammacco F, Silvestris F. 2011. Immature dendritic cells from patients with multiple myeloma are prone to osteoclast differentiation in vitro. Experimental Hematology. 39(7):773-783.e1. https://doi.org/10.1016/j.exphem.2011.04.006

21 - 40

21. Fell LH, Seiler-Mußler S, Sellier AB, Rotter B, Winter P, Sester M, Fliser D, Heine GH, Zawada AM. 2016. Impact of individual intravenous iron preparations on the differentiation of monocytes towards macrophages and dendritic cells. Nephrol. Dial. Transplant.. 31(11):1835-1845. https://doi.org/10.1093/ndt/gfw045

22. Su Q, Igyártó BZ. 2019. Keratinocytes Share Gene Expression Fingerprint with Epidermal Langerhans Cells via mRNA Transfer. Journal of Investigative Dermatology. 139(11):2313-2323.e8. https://doi.org/10.1016/j.jid.2019.05.006

23. Lee D, Cho K. 2005. The effects of epidermal keratinocytes and dermal fibroblasts on the formation of cutaneous basement membrane in three-dimensional culture systems. Arch Dermatol Res. 296(7):296-302. https://doi.org/10.1007/s00403-004-0529-5

24. Díaz-Coránguez M, Segovia J, López-Ornelas A, Puerta-Guardo H, Ludert J, Chávez B, Meraz-Cruz N, González-Mariscal L. Transmigration of Neural Stem Cells across the Blood Brain Barrier Induced by Glioma Cells. PLoS ONE. 8(4):e60655. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0060655

25. Huang S, Liu F, Niu Q, Li Y, Liu C, Zhang L, Ni D, Pu X. GLIPR-2 Overexpression in HK-2 Cells Promotes Cell EMT and Migration through ERK1/2 Activation. PLoS ONE. 8(3):e58574. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0058574

26. den Broeder AA, Wanten GJ, Oyen WJ, Naber T, van Riel PL, Barrera P. Neutrophil migration and production of reactive oxygen species during treatment with a fully human anti-tumor necrosis factor-alpha monoclonal antibody in patients with rheumatoid arthritis. The Journal of rheumatology. 2003; 30(2)232-237:

27. Nishihara H, Soldati S, Mossu A, Rosito M, Rudolph H, Muller WA, Latorre D, Sallusto F, Sospedra M, Martin R, et al. 2020. Human CD4+ T cell subsets differ in their abilities to cross endothelial and epithelial brain barriers in vitro. Fluids Barriers CNS. 17(1): https://doi.org/10.1186/s12987-019-0165-2

28. Zhang R, Wu Y, Zhao M, Liu C, Zhou L, Shen S, Liao S, Yang K, Li Q, Wan H. 2009. Role of HIF-1? in the regulation ACE and ACE2 expression in hypoxic human pulmonary artery smooth muscle cells. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 297(4):L631-L640. https://doi.org/10.1152/ajplung.90415.2008

29. Ning Y, Sun Q, Dong Y, Xu W, Zhang W, Huang H, Li Q. 2011. Slit2-N inhibits PDGF-induced migration in rat airway smooth muscle cells: WASP and Arp2/3 involved. Toxicology. 283(1):32-40. https://doi.org/10.1016/j.tox.2011.01.026

30. Wang Y, Wang HJ, Liao Y, Tsai P, Chen K, Cheng H, Lin R, Juo SH. 2012. MicroRNA-195 regulates vascular smooth muscle cell phenotype and prevents neointimal formation. 95(4):517-526. https://doi.org/10.1093/cvr/cvs223

31. Zhang W, Tang B, Huang Q, Hua Z. 2013. Galangin inhibits tumor growth and metastasis of B16F10 melanoma. J. Cell. Biochem.. 114(1):152-161. https://doi.org/10.1002/jcb.24312

32. Schittek B, Psenner K, Sauer B, Meier F, Iftner T, Garbe C. 2007. The increased expression of Y box-binding protein 1 in melanoma stimulates proliferation and tumor invasion, antagonizes apoptosis and enhances chemoresistance. Int. J. Cancer. 120(10):2110-2118. https://doi.org/10.1002/ijc.22512

33. Meier F, Busch S, Lasithiotakis K, Kulms D, Garbe C, Maczey E, Herlyn M, Schittek B. 2007. Combined targeting of MAPK and AKT signalling pathways is a promising strategy for melanoma treatment. Br J Dermatol. 156(6):1204-1213. https://doi.org/10.1111/j.1365-2133.2007.07821.x

34. Wang Y, Chang S, Wang C, Huang H, Tzeng S. 2020. The selective lipoprotein-associated phospholipase A2 inhibitor darapladib triggers irreversible actions on glioma cell apoptosis and mitochondrial dysfunction. Toxicology and Applied Pharmacology. 402115133. https://doi.org/10.1016/j.taap.2020.115133

35. Bajetto A, Barbieri F, Dorcaratto A, Barbero S, Daga A, Porcile C, Ravetti JL, Zona G, Spaziante R, Corte G, et al. 2006. Expression of CXC chemokine receptors 1?5 and their ligands in human glioma tissues: Role of CXCR4 and SDF1 in glioma cell proliferation and migration. Neurochemistry International. 49(5):423-432. https://doi.org/10.1016/j.neuint.2006.03.003

36. Luo L, Zhang L, Duan C, Wang B, He N, Abulimiti P, Lin Y. 2017. The inhibition role of miR-22 in hepatocellular carcinoma cell migration and invasion via targeting CD147. Cancer Cell Int. 17(1): https://doi.org/10.1186/s12935-016-0380-8

37. Li J, Zhang S, Chen J, Du T, Wang Y, Wang Z. 2009. Modeled microgravity causes changes in the cytoskeleton and focal adhesions, and decreases in migration in malignant human MCF-7 cells. Protoplasma. 238(1-4):23-33. https://doi.org/10.1007/s00709-009-0068-1

38. Baumann L, Prokoph S, Gabriel C, Freudenberg U, Werner C, Beck-Sickinger AG. 2012. A novel, biased-like SDF-1 derivative acts synergistically with starPEG-based heparin hydrogels and improves eEPC migration in vitro. Journal of Controlled Release. 162(1):68-75. https://doi.org/10.1016/j.jconrel.2012.04.049

39. CADET ER, GAFNI RI, MCCARTHY EF, MCCRAY DR, BACHER JD, BARNES KM, BARON J. 2003. MECHANISMS RESPONSIBLE FOR LONGITUDINAL GROWTH OF THE CORTEX. The Journal of Bone and Joint Surgery-American Volume. 85(9):1739-1748. https://doi.org/10.2106/00004623-200309000-00013

40. Zhao F, Li L, Guan L, Yang H, Wu C, Liu Y. 2014. Roles for GP IIb/IIIa and ?v?3 integrins in MDA-MB-231 cell invasion and shear flow-induced cancer cell mechanotransduction. Cancer Letters. 344(1):62-73. https://doi.org/10.1016/j.canlet.2013.10.019

41 - 49

41. Jiang R, Zhang C, Liu G, Gu R, Wu H. MicroRNA-101 inhibits proliferation, migration and invasion in osteosarcoma cells by targeting ROCK1. American journal of cancer research, 2017; 7(1)88:

42. Jia D, Niu Y, Li D, Liu Z. 2018. lncRNA C2dat1 Promotes Cell Proliferation, Migration, and Invasion by Targeting miR-34a-5p in Osteosarcoma Cells. oncol res. 26(5):753-764. https://doi.org/10.3727/096504017x15024946480113

43. Zhang J, Yang W, Zhou Y, Xiang Y, Wang L, Hu W, Wang W. Baicalein inhibits osteosarcoma cell proliferation and invasion through the miR?183/Ezrin pathway. Mol Med Report. https://doi.org/10.3892/mmr.2018.9036

44. Liu Y, Zhao F, Gu W, Yang H, Meng Q, Zhang Y, Yang H, Duan Q. 2009. The Roles of Platelet GPIIb/IIIa and ?v?3 Integrins during HeLa Cells Adhesion, Migration, and Invasion to Monolayer Endothelium under Static and Dynamic Shear Flow. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 20091-9. https://doi.org/10.1155/2009/829243

45. Toyoda K, Tanaka K, Nakagawa S, Thuy DHD, Ujifuku K, Kamada K, Hayashi K, Matsuo T, Nagata I, Niwa M. 2013. Initial Contact of Glioblastoma Cells with Existing Normal Brain Endothelial Cells Strengthen the Barrier Function via Fibroblast Growth Factor 2 Secretion: A New In Vitro Blood?Brain Barrier Model. Cell Mol Neurobiol. 33(4):489-501. https://doi.org/10.1007/s10571-013-9913-z

46. Hu M, Wang C, Li W, Lu W, Bai Z, Qin D, Yan Q, Zhu J, Krueger BJ, Renne R, et al. A KSHV microRNA Directly Targets G Protein-Coupled Receptor Kinase 2 to Promote the Migration and Invasion of Endothelial Cells by Inducing CXCR2 and Activating AKT Signaling. PLoS Pathog. 11(9):e1005171. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1005171

47. Coureuil M, Lécuyer H, Scott MG, Boularan C, Enslen H, Soyer M, Mikaty G, Bourdoulous S, Nassif X, Marullo S. 2010. Meningococcus Hijacks a ?2-Adrenoceptor/?-Arrestin Pathway to Cross Brain Microvasculature Endothelium. Cell. 143(7):1149-1160. https://doi.org/10.1016/j.cell.2010.11.035

48. Almajed FS, Forsythe SJ. 2016. Cronobacter sakazakii clinical isolates overcome host barriers and evade the immune response. Microbial Pathogenesis. 9055-63. https://doi.org/10.1016/j.micpath.2015.11.014

49. Tian X, Hu T, Zhang H, He L, Huang X, Liu Q, Yu W, He L, Yang Z, Zhang Z, et al. 2013. Subepicardial endothelial cells invade the embryonic ventricle wall to form coronary arteries. Cell Res. 23(9):1075-1090. https://doi.org/10.1038/cr.2013.83