Koncentrace viru pomocí ultrafiltrace

• Izolace, šíření a charakterizace virů
• Obecné metody pro šíření virů
• Koncentrace virů pro zásoby virů s vysokým titrem
• Koncentrace virů pomocí Amiconu^® ultracentrifugálními ultrafiltračními zařízeními
• Závěry
• Centrifugální ultrafiltrační zařízení

Izolace, šíření a charakterizace virů

Obrázek 1. Ultrafiltrace pro koncentraci viru. Tekutina prochází membránovým filtrem, zatímco velké virové částice jsou zadrženy.

Metody izolace a množení virů mají zásadní význam pro výzkum, výrobu vakcín a diagnostické postupy. Laboratoře základního výzkumu používají virové zásoby ke studiu virové biologie a patogeneze. Výroba vakcín vyžaduje přípravu virů v malém i velkém měřítku. A přestože většina diagnostických laboratoří nyní používá pro diagnostiku virových onemocnění nekultivační přístupy, izolace virů v buněčných kulturách zůstává užitečným přístupem v případech, kdy jsou zapotřebí životaschopné izoláty, kdy je třeba rozlišit životaschopný a neživotaschopný virus, a v případech, kdy jsou metody založené na kultivaci schopny poskytnout výsledky rychleji než metody nekultivační.

Viry lze množit v buněčných kulturách a vytvářet tak zásoby virů. Kultivované buňky jsou inokulovány virovou zásobou ze semenného viru, komerčního zdroje nebo infikované tkáně. Po inkubaci se infikované buňky lyzují, aby se sklidily virové částice, nebo se uvolněný virus sklízí přímo z buněčného supernatantu. Virová zásoba se poté titruje, alikvotuje a uchovává při -80 °C pro pozdější použití.

Isolace viru z klinických vzorků rovněž využívá buněčné kultury pro množení viru. Klinické vzorky se připravují homogenizací vzorku a extrakcí do tekutého média, které se následně odstředí a použije k inokulaci buněčných kultur.

Pro dosažení vysokého titru virových zásob je nutné purifikované virové částice koncentrovat. Ke koncentraci virionů a virových roztoků lze použít odstředivá ultrafiltrační zařízení Amicon^® Ultra a Centricon^® Plus s regenerovanými celulózovými membránami (obrázek 1). Tento protokol popisuje použití odstředivých ultrafiltračních zařízení Amicon^® a Centricon^® pro koncentraci tří běžných typů virů: lentiviru, adenoviru a adenoasociovaného viru (AAV).

Obecná metoda šíření virů

1. Balení buněk: Hostitelské buňky byly naneseny tak, aby bylo dosaženo 80-85% konfluence.
2. Transfekce: Buňky byly infikovány životaschopnými virovými částicemi.
3. Sklizeň viru: V závislosti na viru byl k purifikaci rekombinantních virionů použit buď buněčný supernatant, nebo peletované buňky, případně obojí. K uvolnění viru z buněk byly použity čtyři cykly zmrazení/rozmrazení. Buněčné zbytky byly poté odděleny od buněčného lyzátu centrifugací. 
   
4. Purifikace viru: Virus byl purifikován z buněčného lyzátu pomocí ultracentrifugace s gradientem hustoty nebo pomocí kolonové/membránové chromatografie.
5. Purifikované roztoky viru byly zahuštěny a vyměněny za pufr do vhodného skladovacího roztoku buď pasivní dialýzou, diafiltrací, nebo odstředivou ultrafiltrací pomocí přístrojů Amicon^® Ultra a Centricon^® Plus 70. V případě, že byl virus přečištěn, byl použit pufr.

Koncentrace viru pro zásoby viru s vysokým titrem

Pro výrobu zásob viru s vysokým titrem lze purifikovaný virus koncentrovat pomocí odstředivé ultrafiltrace. Pro vysokou výtěžnost infekčních virových částic je rozhodující správná volba zařízení, materiálu membrány, limitu molekulové hmotnosti nebo mezní hodnoty, rychlosti centrifugace, doby centrifugace a složení pufru. Centrifugační ultrafiltrační jednotky Amicon^® Ultra mají specifikované nominální limity molekulové hmotnosti (NMWL) definované jejich filtrační membránou. Ke koncentraci roztoků adenoviru a adenoasociovaného viru (AAV) byla použita odstředivá ultrafiltrační zařízení Amicon^® Ultra s NMWL 50 kDa Ultracel^® . Pro koncentraci lentiviru byla použita zařízení s membránami NMWL 50 kDa i 100 kDa.

Faktory, které je třeba zvážit při výběru metody ultrafiltrace a jmenovité molekulové hmotnosti membrány:

1. Virální částice: Velikost lze odhadnout z publikovaných zdrojů nebo pomocí měřicích technik, jako je mikroskopie, laserová difrakce a dynamický rozptyl světla.
2. Velikost klíčových separačních cílů v roztoku: Velikost proteinů, protilátek, léčiv, chemických látek a dalších částic, které je třeba separovat, ovlivní výběr velikosti membrány.
3. Objem vzorku: Zpracovávané objemy od ≤0,5 ml do 70 ml jsou kompatibilní se zařízeními pro odstředivou ultrafiltraci (cUF).

Pro zadržení virových částic musí být mezní molekulová hmotnost filtrační membrány menší než částice (~2krát menší než molekulová hmotnost virové částice), ale dostatečně velká, aby umožnila filtraci menších složek
(tabulka 1).

Tabulka 1. Výběr ultrafiltrační membrány NMWL na základě velikosti virových částic.

Ultrafiltrační membrána NMWL (kDa)	Nominální velikost pórů (nm)	Doporučený rozsah jmenovité velikosti ultrafiltrace
		Průměr (nm)		Molekulová hmotnost (kDa)
		Minimální	Maximum	Minimum	Maximum
3	0.3	1	1.5	6	20
10	1	3	9	20	90
30	3	9	15	60	180
50	5	15	30	100	300
100	10	30	90	200	900

Koncentrace viru pomocí ultrafiltračních odstředivých zařízení Amicon^® Ultra

Tabulka 2 uvádí výsledky koncentrace adenoviru, lentiviru a AAV ze surového buněčného lyzátu i viru přečištěného chromatografií. Virové částice byly účinně koncentrovány na vysoké titry s vysokou výtěžností pomocí odstředivých ultrafiltračních zařízení Amicon^® Ultra.

Tabulka 2. Koncentrace viru pomocí ultrafiltračních zařízení. Nedoporučujeme koncentrovat virus na více než 1013 částic/ml z důvodu možné agregace viru.

Vstupní vzorek	Zařízení	Vstupní titr viru	Vstupní objem (ml)	Koncentrační faktor	Doba odstřeďování při 1500 x g (min)	Výtěžnost (%)
Adenovirus v surovém buněčném lyzátu	Amicon®<./sup> Ultra-4 50 kDa	1 x 108	4	27X	20	>100
Adenovirus purifikovaný, v 1M solném pufru
Amicon® Ultra-4 50 kDa/td>	1 x 108	4	45X	10	85
AAV v surovém buněčném lyzátu	Amicon® Ultra-4 50 kDa	2 x 107	4	20X	35	50
AAV v surovém buněčném lyzátu	Amicon®Ultra-15 50 kDa	2 x 107	10	25X	45	76
AAV zředěná v pufru 100 mM Tris, 250 mM NaCl	Amicon® Ultra-4 50 kDa	5 x 106	4	20X	20	100
Lentivirus v supernatantu buněčné kultury	Amicon® Ultra-4 100 kDa	9 x 104	4	100X	4	4	30	>100
Lentivirus v supernatantu buněčné kultury	Amicon®	Amicon® Ultra-4 50 kDa	9 x 104	4	100x	30	93
Lentivirus v supernatantu buněčné kultury	Centricon Plus-70 100 kDa	8 x 103	65	80X	30	81

Je důležité si uvědomit, že většinu virů nelze účinně koncentrovat a uchovávat v pufrech s nízkým obsahem soli. Centrifugální koncentrace viru v < 250 mM solných roztocích vede k agregaci viru a snížení infekčnosti.

Koncentrovanou virovou zásobu lze sterilizovat filtrem přes 0.22 µm filtry. Filtrační jednotky Ultrafree^®-MC GV lze použít pro objemy < 0.5 ml.

Závěry

Vyvinuli jsme metodu validace ultrafiltrace pomocí filtrů Amicon<....sup>® Ultra a Centricon^® Plus jako rychlého a nákladově efektivního prostředku k dosažení vysokých titrů virů. Tuto metodu lze použít ke koncentraci virů ze supernatantů buněčných kultur, buněčných lyzátů a dalších zdrojů. Po zkoncentrování lze virovou zásobu sterilizovat pomocí filtračních jednotek Ultrafree^® . Pro co nejvyšší výtěžnost infekčních virových částic je zásadní zvolit správné ultrafiltrační zařízení, membránový filtr, mezní molekulovou hmotnost (MWCO), rychlost centrifugace a dobu centrifugace.

Centrifugační ultrafiltrační zařízení

Nominální mezní molekulová hmotnost zařízení, NMWL (kDa)	Amicon® Ultra odstředivé ultrafiltrační zařízení				Centricon® Plus 70 odstředivých zařízení
	0.5 ml	2 ml	4 ml <./td>	15 ml	15 - 70 ml
3	UFC5003		UFC8003	UFC9003	UFC7003
10	UFC5010	UFC2010	UFC8010	UFC9010	UFC7010
10 (IVD*)			UFC4010D*	UFC9010D*
30	UFC5030	UFC2030	UFC8030	UFC9030	UFC7030
50	UFC5050	UFC2050	UFC8050
100	UFC5100	UFC2100	UFC8100	UFC9100	UFC7100

* registrováno pro použití v IVD