Secuenciación
La capacidad para determinar la composición y el orden de los ácidos nucleicos en una cadena de ADN o ARN tiene profundas implicaciones para comprender la genética moderna y numerosos campos que son esenciales para la investigación de enfermedades y una mejor comprensión de todos los organismos. La capacidad para secuenciar ácidos nucleicos no sólo es útil para descifrar el código genético de un organismo, sino que también proporciona a los investigadores una potente herramienta, en combinación con otras tecnologías moleculares, para manipular fácilmente las secuencias de ADN y verificar esos cambios mediante secuenciación. Dado que el ADN codificante funciona como información codificada de las proteínas, los investigadores pueden ahora diseñar a medida proteínas recombinantes que contengan una gran variedad de elementos funcionales, que se utilizan ampliamente para responder a un número igual de grande de preguntas experimentales importantes. Si desea guías y reactivos adicionales para la secuenciación del genoma completo, visite el recurso Secuenciación de nueva generación .
Secuenciación de Sanger
Al principio, la composición de los ácidos nucleicos pudo determinarse utilizando métodos de química analítica. Sin embargo, empleando inicialmente fragmentos radiomarcados digeridos y fraccionamiento bidimensional, Fred Sanger y sus colegas desarrollaron métodos que permitieron proporcionar algunas de las primeras secuencias nucleicas completas. Los avances en el campo continuaron durante décadas y cada mejora se fue sumando a una creciente colección de de proteínas y genomas secuenciados. Una de esas mejoras fue la separación de nucleótidos por longitud utilizando electroforesis en gel seguida de electroforesis capilar. Además, la incorporación de nucleótidos marcados con fluorescencia y el análisis automatizado por ordenador de cada fragmento de ácido nucleico definen ahora el método moderno de secuenciación de Sanger.
Metodología de secuenciación del ADN
Si bien los métodos para secuenciar el ADN han seguido mejorando desde el origen de esta tecnología, siguen siendo necesarios varios componentes fundamentales, que se utilizan en las plataformas modernas de secuenciación del ADN. La preparación del ADN consiste normalmente en el aislamiento y la purificación del ADN del organismo anfitrión. Se añaden a un único recipiente otros componentes fundamentales, como bases de ADN libres, cebadores de ADN, bases de ADN modificadas que contienen etiquetas fluorescentes (bases terminadoras) y ADN polimerasa. El recipiente que contiene todos estos componentes producirá a través de una serie de etapas de calentamiento y enfriamiento una colección de secuencias de ADN pequeñas con respecto a la secuencia de ADN de longitud completa de interés, cada una de las cuales terminará con una base de terminación marcada con fluorescencia. Las nuevas hebras de ADN que contienen los nucleótidos terminalmente marcados con fluorescencia se separan por longitud, se hacen pasar a través de un tubo capilar y se organizan por tamaño. A continuación, se utiliza un láser para excitar la base fluorescente en cada hebra mientras una cámara capta la señal. Por último, suele utilizarse un ordenador para reunir la información recogida en la secuencia de ADN completa.
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