Come affrontare le contaminazioni delle colture cellulari
Informazioni generali
Tipi di contaminazione
Cause comuni di contaminazione
microbica (batteri, funghi, lieviti) e prevenzione
Micoplasmi
Contaminazione virale
Contaminazione chimica
Consigli generali e tecniche
Lavorare nella cabina di sicurezza biologica
Pipettaggio e prevenzione della formazione di aerosol
Disinfezione
Monitoraggio quotidiano delle cellule sane
Contaminazione delle colture: informazioni generali
Malgrado l’affermazione “contaminazione delle colture” richiami alla mente la presenza di batteri tra le cellule e l’intorbidimento del terreno, gli invasori indesiderati nella fiasca di coltura possono assumere molte forme. Anche i contaminanti virali e chimici possono avere infatti conseguenze importanti sulla salute della coltura, senza contare che la certezza dell’assenza di contaminazioni crociate tra linee cellulari è fondamentale per la riproducibilità dei risultati.
Quanto è pervasiva la contaminazione delle colture cellulari? Secondo studi condotti da FDA, ATCC e altri, si stima che attualmente le sole specie di micoplasma siano responsabili della contaminazione di ben il 5–30% di tutte le colture cellulari. Uno studio ha rilevato come l’incidenza della contaminazione virale all’interno di linee cellulari comuni superasse il 25%,5 questo perché i virus non citopatici sono meno facilmente rilevabili rispetto ai micoplasmi, dato che non sempre la loro presenza è deducibile dallo stato di salute della coltura.
Figura 1.Contaminazione di una coltura cellulare
La chiave per controllare uno specifico contaminante talvolta dipende dalla facilità con cui questo viene individuato. I batteri, i funghi e i lieviti contaminanti spesso sono visibili a occhio nudo e possono uccidere rapidamente le cellule in coltura, invece la morfologia sottile dei micoplasmi può complicare notevolmente l’identificazione di questi intrusi microbici indesiderati. I virus invece non sono visibili al microscopio ottico, quindi la loro presenza va dedotta dalla pronta osservazione di un distacco inspiegabile delle cellule o da altri segni indicativi di uno scarso stato di salute o anche dalla morte delle cellule.
Negli ultimi anni, uno dei principali timori condivisi dalla comunità dei biologi è la contaminazione o anche la vera e propria errata identificazione delle linee cellulari utilizzate nella ricerca. Per approfondire questo importante argomento, cliccate qui per conoscere le cause e la prevalenza delle linee cellulari che hanno subito contaminazione crociata e per scoprire come valutare l’integrità dell’identità delle linee cellulari.
La contaminazione da batteri, funghi (incluse le muffe) e lieviti è visibile a occhio nudo quando il terreno di coltura diventa improvvisamente torbido e cambia colore (nel caso il terreno sia supplementato con rosso fenolo, l’indicatore di pH atossico più comune). Al microscopio ottico le cellule batteriche e le strutture fungine sono ben visibili, quindi l’osservazione quotidiana delle colture al microscopio permette di identificare precocemente una contaminazione batterica e di adottare prontamente le misure adatte. In particolare, bisogna eliminare subito la coltura contaminata per proteggere non solo le altre colture cellulari, ma anche l’ambiente sterile in cui queste vengono coltivate/manipolate, come gli incubatori, i bagni termostatati e anche la cabina di sicurezza biologica. L’esecuzione di specifici test per la ricerca di batteri e funghi va inoltre prevista di routine nell’ambito di una regolare procedura di screening del controllo qualità.
Cause comuni di contaminazione microbica e prevenzione
I micoplasmi sono un genere di batteri privi di parete cellulare e perciò non sono influenzati dagli antibiotici che limitano la crescita batterica inibendo la formazione della parete cellulare. La loro morfologia flessibile e le dimensioni pari a 0,15-0,3 µm permettono loro di eludere gli approcci di filtrazione standard delle colture cellulari che spesso avvengono con filtri con pori da 0,22 µm. Diversamente dalla maggioranza degli altri contaminanti batterici, i micoplasmi non sono identificabili a un’ispezione causale e sono difficili da rilevare in microscopia ottica per via della loro morfologia e delle dimensioni molto piccole. Il titolo dei micoplasmi in una coltura può arrivare a 108 microrganismi/mL senza che il terreno diventi torbido. Solitamente non uccidono le cellule mammifere infettate, ma compromettono significativamente le colture perché alterano il metabolismo cellulare, causano aberrazioni cromosomiche, rallentano la crescita e interferiscono con l’adesione delle cellule. In breve, possono influenzare notevolmente i risultati della maggior parte degli esperimenti su linee cellulari infettate.
Figura 2.I comuni agenti di rilevamento del DNA come il DAPI o l’Hoechst rivelano la presenza dei micoplasmi nelle colture contaminate (destra) mediante l’analisi in microscopia a fluorescenza.
Le possibili fonti di contaminazione da micoplasmi in laboratorio sono svariate e di difficile gestione. Poiché alcune specie di micoplasmi sono presenti sulla cute umana, questi possono essere introdotti se la tecnica non è perfettamente asettica, oppure quando si usano supplementi contaminati come il siero fetale bovino. I micoplasmi si trasmettono facilmente tra colture cellulari vicine. Per l’esclusione dei micoplasmi, è necessario filtrare terreni e tamponi con membrane dotate di pori pari o inferiori a 0,1 µm, dato che questi piccoli microrganismi non vengono trattenuti dai dispositivi standard di filtrazione con pori da 0,22 o 0,45 µm.
Prevenire, identificare ed eliminare la contaminazione da micoplasmi
Quando il micoplasma contamina una coltura, può rapidamente diffondersi ad altri settori del laboratorio. Per un controllo efficace della contaminazione da micoplasmi è quindi fondamentale attenersi scrupolosamente alle buone pratiche di laboratorio, così come è vivamente raccomandata l’esecuzione di routine dei relativi saggi sulle colture. I tre metodi più usati per la rilevazione sono la coltura di micoplasmi, il metodo della colorazione del DNA e l’identificazione basata sulla PCR. Offriamo svariate soluzioni per la Identificazione ed eliminazione dei micoplasmi. Anche se non si sospetta la presenza di questo contaminante in laboratorio, è essenziale adottare una consuetudine per lo screening delle colture.
Prevenzione delle contaminazioni microbiche: gli antibiotici sono la risposta? Nelle colture tissutali si aggiungono abitualmente antibiotici, sia da soli sia abbinati ad antimicotici. Proprio come nel caso delle antibioticoterapie prescritte dai medici, l’uso continuo e inappropriato di antibiotici può indurre lo sviluppo di ceppi resistenti difficili da eradicare, per i quali può essere necessario ricorrere agli antibiotici di ultima generazione, che possono però essere tossici per le cellule in coltura. Studi recenti hanno sollevato ulteriori dubbi circa la possibilità di alterazioni dell’espressione genica nelle cellule coltivate in presenza di antibiotici. |
Contaminazione virale
I virus sono tra i contaminanti cellulari più difficili da identificare nelle colture, perché richiedono metodi di microscopia impraticabili nella maggioranza dei laboratori di ricerca. Possono derivare dal paziente originario o dalla cellula animale ospite, senza contare che molte linee cellulari a uso biotecnologico sono risultate contenere retrovirus endogeni. Più spesso le cellule vengono infettate da virus presenti nei materiali di origine animale usati per coltivarle. Le piccole dimensioni dei virus ne complicano la rimozione da terreni, sieri e altre soluzioni di origine biologica. Tuttavia, poiché lo spettro d’ospite e anche del tipo di tessuto dei virus è molto limitato, la loro capacità di infezione crociata tra specie o tessuti è limitata. Malgrado la loro presenza nelle colture cellulari possa essere più frequente di quanto i ricercatori pensino, se i virus non inducono effetti citopatici o avversi di altro tipo sulle cellule non sempre rappresentano un fattore di confondimento significativo per la coltura cellulare.
Oltre al loro potenziale impatto sulle cellule in coltura, una delle principali preoccupazioni circa l’uso di colture cellulari infettate da virus è il potenziale rischio a cui è esposto il personale del laboratorio. Quando si lavora con tessuti o cellule di origine umana o di altro primate, vanno sempre adottate precauzioni speciali per la sicurezza, per evitare la possibile trasmissione dell’infezione virale (HIV, epatite B, virus Epstein-Barr, Herpes virus B di scimmia, tra gli altri) dalle colture cellulari al personale del laboratorio. Prima di lavorare con tessuti, colture o virus potenzialmente pericolosi vanno sempre consultati i responsabili istituzionali preposti alla sicurezza ambientale. Per approfondire il tema della valutazione del rischio per il personale di laboratorio che lavora con le colture cellulari, cliccate qui
Migliori pratiche per ridurre l’incidenza di contaminazione virale delle colture cellulari
*Limitare il numero di fonti biologiche (fornitori, animali) da cui vengono estratte le cellule.
*Scegliere animali/cellule noti per essere meno sensibili ai virus.
*Approvvigionarsi da fornitori che conducono i test sui virus e che ne certificano l’assenza nelle linee cellulari.
Contaminazione chimica
Qualsiasi contaminante non vivente delle colture cellulari spesso è classificato come contaminante “chimico”. Questi contaminanti posso originare dai reagenti o dall’acqua usati per i terreni o i tamponi oppure dalle attrezzature e dalle forniture. Esempi sono radicali liberi, ioni metallici, disinfettanti/detergenti residui o anche endotossine che persistono dopo che i contaminanti a monte non sono più presenti.
Consigli per prevenire la contaminazione chimica
*Usare sempre acqua di grado laboratorio per preparare tamponi e soluzioni e per risospendere i reagenti liofilizzati.
*Tutta la vetreria riutilizzabile deve essere risciacquata molto bene e asciugata all’aria; il passaggio in autoclave non rimuove i residui di detergente.
*Acquistare terreni, supplementi e sieri (FBS, FCS) solo da fornitori che rilascino certificazioni sull’esecuzione dei test sulle endotossine.
Consigli generali e tecniche per prevenire ed eliminare le contaminazioni
Lavorare nella cabina di sicurezza biologica
Quando si lavora nella cabina di sicurezza biologica è utile ricordare che il flusso d’aria è cruciale per mantenere la sterilità dell’ambiente. Perché il flusso d'aria sia ottimale, sia le ventole anteriori che quelle posteriori non devono essere ostruite in alcun modo. Prima di qualsiasi procedura pratica, la cabina deve essere approntata con tutti i materiali necessari, per evitare la possibilità di trasferire contaminanti presenti sulle maniche del camice e sulle mani dell’operatore.
Prima di collocare i materiali all’interno della cabina devono essere trascorsi almeno 20 minuti dall’attivazione del flusso d'aria. Tutti i materiali che entrano nella cabina devono essere prima spruzzati con alcol sterile al 70% (v/v) e passati con panni privi di pelucchi per non introdurre polvere e particelle. Prima di aprire qualsiasi coperchio o contenitore, accertarsi che il flusso d'aria sia pienamente operativo affinché possa abbattere tutte le particelle che potrebbero essere state introdotte.
Figura 3.Lavorare nella cabina di sicurezza biologica
Pipettaggio e prevenzione della formazione di aerosol
Le pipette di plastica monouso, chiamate anche pipette sierologiche e disponibili con capacità compresa tra 1 e 100 mL, sono strumenti indispensabili per le colture cellulari. Devono essere impacchettate singolarmente per garantire la sterilità. L’adozione delle seguenti indicazioni può ridurre al minimo il rischio di contaminazione e i rischi connessi al pipettaggio.
- Utilizzare pipettatori automatici, limitando l’uso di ciascuno di essi all’interno di una sola cabina. Per evitare contaminazioni, smontare e disinfettare regolarmente le parti del pipettatore. Accertarsi che le scorte di filtri per i pipettatori siano sempre ben fornite e che i filtri vengano cambiati regolarmente.
- Ogni qualvolta possibile, utilizzare pipette dotate di tampone di cotone all’estremità, specialmente quando si trasferiscono i terreni. Evitare di aspirare il liquido nel tampone di cotone. Se il tampone si bagna accidentalmente, cambiare immediatamente il filtro del pipettatore.
- Per evitare del tutto di toccare la pipetta sierologica, spacchettarla solo parzialmente, inserire la pipetta nel pipettatore e solo a quel punto rimuovere l’involucro di carta.
- Per non generare aerosol contaminanti, evitare la formazione di bolle nei liquidi o nella pipetta.
Disinfezione
I metodi indicati per la disinfezione/decontaminazione degli scarti delle colture, delle superfici di lavoro e della attrezzature non solo devono minimizzare il rischio di contaminazione, ma devono anche essere sicuri per il personale del laboratorio. Quando si maneggiano forme concentrate di disinfettanti, indossare sempre dispositivi di protezione individuale (PPE), come guanti e occhiali protettivi. A seconda della sostanza in uso esistono guanti di protezione specifici. Le tabelle dei produttori aiutano a identificare i guanti migliori per una data attività. I principali disinfettanti sono suddivisi in gruppi, le cui rispettive destinazioni d’uso sono riassunte di seguito.
Ipoclorito di sodio o candeggina
- Buon disinfettante per usi generici
- Attivo contro i virus
- Corrosivo sui metalli—non va usato su superfici metalliche come le centrifughe
- Subito inattivato dalla materia organica, quindi va preparato fresco frequentemente
- Utilizzare la candeggina commerciale per preparare una diluizione al 10% (v/v) da aggiungere ai liquidi di scarto o per la disinfezione delle superfici
Alcol (per es. etanolo, isopropanolo)
- Concentrazione efficace: 70% etanolo, 60-70% isopropanolo
- Efficace contro i batteri. L’etanolo è efficace contro la maggioranza dei virus, tranne quelli privi di capside
- L’isopropanolo non è efficace contro i virus
- Le aldeidi sono irritanti quindi il loro uso va limitato
I disinfettanti a base fenolica vanno evitati perché non rientrano nel programma di revisione della Direttiva sulle sostanze attive dei biocidi della UE.
Monitoraggio quotidiano delle cellule sane
Il monitoraggio delle cellule è una parte importante della routine quotidiana di un laboratorio di colture cellulari. In questo tutorial si spiegano le nozioni di base per monitorare le cellule, compreso anche l’aspetto delle cellule sane, la confluenza cellulare e le diverse fasi di crescita della coltura cellulare. Nel video sono mostrati anche gli indicatori più frequenti di contaminazione batterica e da micoplasmi.
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Bibliografia
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