Studio sui filtri da siringa Millex^® per la determinazione di impurezze appartenenti alla classe delle nitrosammine nei farmaci

• Determinazione delle impurezze appartenenti alla classe delle nitrosammine
  • Requisiti normativi
  • Metodi analitici
  • Requisiti per la filtrazione dei campioni
• Metodo sperimentale
• Esame dei filtri per l'analisi delle nitrosammine
  • Estraibili
  • Recuperi
• Determinazione delle impurezze appartenenti alla classe delle nitrosammine e scelta dei filtri
• Prodotti correlati
• Applicazioni correlate
• Bibliografia

Determinazione delle impurezze appartenenti alla classe delle nitrosammine

L'individuazione e la quantificazione delle nitrosammine nei medicinali è essenziale per garantire la sicurezza e la qualità dei prodotti farmaceutici. Si sospetta, infatti, che queste sostanze abbiano proprietà cancerogene e genotossiche e che rappresentino, quindi, un rischio per la salute dei pazienti.^1-4 Introdotte nei processi di sintesi attraverso molteplici vie difficili da prevedere, le impurezze da nitrosammine sono state rilevate in principi attivi ed eccipienti farmaceutici, il che ha determinato numerosi richiami di prodotti a partire dal 2018, tra cui quello del valsartan.^5,6

Requisiti normativi per le analisi delle nitrosammine

Le agenzie di regolamentazione dei prodotti farmaceutici e organizzazioni come l'U.S. Food and Drug Administration (FDA), l’Agenzia Europea per i Medicinali (EMA) e l’International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use (ICH) hanno emanato linee guida e requisiti concernenti le nitrosammine nei prodotti farmaceutici. Una sintesi dei punti fondamentali è riportata in Tabella 1.

Tabella 1. Linee guida e requisiti stabiliti da alcune agenzie e organizzazioni di regolamentazione dei prodotti farmaceutici concernenti le impurezze appartenenti alla classe delle nitrosammine nei prodotti farmaceutici.

Ente	Linea/e guida concernente/i le impurezze da nitrosammine
U.S. FDA7	Una linea guida raccomanda le misure che i produttori di API e di prodotti farmaceutici devono adottare per individuare e prevenire livelli inaccettabili di impurezze da nitrosammine nei prodotti farmaceutici. Si richiede che le aziende farmaceutiche identifichino le potenziali fonti di impurezze da nitrosammine, si preoccupino della valutazione del rischio e adottino le misure appropriate per evitare la contaminazione. Raccomanda metodi analitici come la spettrometria di massa e altre tecniche adeguate per analizzare le nitrosammine nei prodotti farmaceutici.
EMA8	Pubblicate linee guida e raccomandazioni per la prevenzione, l'individuazione e la riduzione del rischio correlato alle impurezze da nitrosammine nei medicinali per uso umano. Indica valori soglia e limiti massimi per quanto riguarda la contaminazione da nitrosammine specifiche in varie classi di farmaci. I produttori sono tenuti a eseguire valutazioni del rischio, a condurre analisi e a riferire alle autorità regolatorie eventuali impurezze da nitrosammine riscontrate.
Health Canada9	Richiede ai produttori di valutare e mitigare la presenza di nitrosammine nei prodotti, il che implica l'esecuzione di valutazioni del rischio e l'attuazione di misure preventive adeguate.
Pharmaceuticals and Medical Devices Agency (PMDA) – Giappone10	Pubblicate linee guida in merito all'individuazione e al controllo delle impurezze da nitrosammine nei prodotti medicinali. Tali linee guida contengono raccomandazioni per la valutazione del rischio, metodi di analisi e strategie per il controllo e la prevenzione.
Health Science Authority (HSA) – Singapore11	Ha richiesto che i titolari della registrazione di prodotti farmaceutici effettuino valutazioni del rischio dei loro prodotti per quanto riguarda le impurezze da nitrosammine. Ha sviluppato metodi analitici per l'identificazione e la determinazione delle impurezze da nitrosammine nei medicinali.
Taiwan FDA12	Ha notificato ai titolari di licenza la necessità di valutare il rischio e di esaminare in modo proattivo la presenza di nitrosammine nei prodotti farmaceutici. Ha sviluppato metodi analitici raccomandati per l'individuazione di impurezze da nitrosammine.
ICH4	Ha classificato le nitrosammine come impurezze di Classe 1, “Note mutagene cancerogene”.  Ha pubblicato la linea guida M7, che si concentra sulla valutazione e sul controllo delle impurezze reattive con il DNA (mutagene) nei prodotti farmaceutici, per limitare il potenziale rischio cancerogeno. Si prefigge di armonizzare i metodi esistenti previsti dalle diverse agenzie regolatorie e dalle farmacopee di tutto il mondo.

Queste autorità di regolamentazione continuano a monitorare attivamente e ad aggiornare le loro linee guida sulle impurezze da nitrosammine per garantire la salute e la sicurezza pubblica. È importante che i produttori farmaceutici si attengano a tali linee guida e a questi requisiti, valutando e mitigando il rischio di contaminazione da nitrosammine nei farmaci.

Metodi analitici per l’analisi delle nitrosammine

Le agenzie di regolamentazione di tutto il mondo, come EMA, U.S. FDA e altre, hanno sottolineato l'importanza di metodi analitici robusti per l'analisi delle nitrosammine nei prodotti farmaceutici. La LC-MS/MS è uno dei metodi analitici comunemente raccomandati dalle agenzie di regolamentazione per l'analisi delle nitrosammine. La combinazione della separazione ottenuta mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) con la rivelazione della spettrometria di massa tandem (MS/MS) assicura sensibilità, selettività e accuratezza elevate. La LC-MS/MS è in grado di rilevare e quantificare diverse nitrosammine fino a livelli di tracce in matrici complesse, il che ne fa una tecnica adatta per le analisi di routine e per il rispetto dei limiti stabiliti dalle normative. La Procedura 3 descritta in USP <1469> si avvale della LC-MS/MS per la quantificazione delle nitrosammine.¹³ Inoltre, U.S. FDA, Farmacopea Europea¹⁴, Health Sciences Agency (HSA) di Singapore,¹⁵ e Taiwan Food and Drug Administration¹⁶ hanno pubblicato metodi LC-MS/MS per la determinazione delle nitrosammine nella ranitidina e in altri medicinali.

L’HPLC accoppiata alla spettrometria di massa ad alta risoluzione (HPLC-HRMS o LC-HRMS) è un’altra tecnica fondamentale per l’analisi delle nitrosammine. La selettività di questo metodo ha consentito di differenziare tra impurezze nitrosammino-simili e nitrosammine effettive, assicurando risultati analitici affidabili. La FDA ha sviluppato e convalidato metodi LC-HRMS¹⁷ e anche la Procedura 1 descritta in USP <1469> fa riferimento a questo metodo.⁷

Per l’analisi delle nitrosammine, si può impiegare anche l’HPLC con rivelazione UV/Vis. Benché questa tecnica possa essere caratterizzato da minore sensibilità rispetto alla LC-MS/MS, essa può costituire un metodo rapido per l’analisi di materie prime, solventi o eccipienti. L’Agence Nationale de Sécurité du Médicament et des Produits de Santé (ANSM) prevede due metodi basati sull’HPLC-UV.^18,19

La gascromatografia accoppiata alla spettrometria di massa (GC-MS/MS) è un’altra tecnica comunemente impiegata per l’analisi delle nitrosammine in quanto offre sensibilità e specificità eccellenti nell’individuazione delle nitrosammine ed è particolarmente utile nel caso di nitrosammine volatili. USP <1469>,¹⁰ Taiwan FDA,¹³ e Swissmedic²⁰ si avvalgono di metodi GC-MS/MS per l’analisi delle nitrosammine, mentre l’Health Sciences Agency (HSA) di Singapore ha pubblicato un metodo basato sulla gascromatografia accoppiata alla spettrometria di massa ad alta risoluzione e accuratezza (HRAM-GCMS).²¹

Requisiti della filtrazione dei campioni per l’analisi delle nitrosammine

La maggior parte dei metodi fin qui menzionati richiede la filtrazione dei campioni prima dell'iniezione. La filtrazione è il modo più semplice per rimuovere prima dell'iniezione le particelle presenti nei campioni e nelle fasi mobili, che potrebbero influenzare significativamente le prestazioni di un HPLC. Nei prodotti farmaceutici come il valsartan le particelle sono molto comuni; esse si originano nel processo di dissoluzione della formulazione. La classificazione di un filtro a membrana sulla base delle dimensione dei suoi pori dà un'indicazione della misura delle particelle che il filtro può trattenere; nei metodi HPLC solitamente si consigliano filtri da 0,45 µm. Quando si utilizzano colonne impaccate con particelle particolarmente fini (ad esempio, inferiori a 2 µm di diametro) e in UHPLC, si raccomandano filtri da 0,2 μm. È importante notare che a parità di dimensione dei pori, i filtri a membrana non presentano sempre la stessa efficienza di ritenzione, come dimostrato in uno studio precedente.²²

In Tabella 2 sono elencate le fasi di filtrazione previste in alcuni metodi pubblicati dalle agenzie di regolamentazione di tutto il mondo. Per i metodi analitici delle nitrosammine, si preferisce il ricorso ai filtri da siringa. Due caratteristiche importanti dei filtri da siringa di cui tener conto sono il materiale costitutivo della membrana filtrante e la dimensione dei pori. Il PVDF e il PTFE sono i materiali dei filtri a membrana più comunemente citati nei metodi analitici pubblicati; in alcuni casi vengono citati anche il nylon e il polipropilene idrofilo (ad esempio, la membrana GHP) (Tabella 2). Le dimensioni dei pori suggerite nei diversi metodi sono 0,2, 0,22 e 0,45 μm.

Tabella 2. Requisiti di filtrazione in alcuni metodi analitici per la determinazione delle impurezze appartenenti alla classe delle nitrosammine stabiliti da diverse agenzie di regolamentazione nel mondo.

Ente	Metodo	Filtrazione
U.S. FDA	Metodo LC-ESI-HRMS per la determinazione delle impurezze da nitrosammine nel principio attivo metformina e nei prodotti finiti che la contengono23	“Filtrare il surnatante utilizzando un filtro da siringa in PVDF da 0,22 µm”
	Metodo LC-HRMS per la determinazione di sei nitrosammine in farmaci a base di antagonisti del recettore dell’angiotensina II (ARB)24	“Filtrare il surnatante utilizzando un filtro da siringa in PVDF da 0,22 µm”
USP10	< 1469> Impurezze appartenenti alla classe delle nitrosammine
	Procedura 1	“Filtrare la soluzione con un filtro appropriato con pori di 0,2 μm.”
	Procedura 3	“Filtrare in un flaconcino utilizzando un filtro in politetrafluoroetilene (PTFE) idrofilo con pori di 0,45 μm.”
	Procedura 4	“…filtro di nylon da 0,45 μm. Filtrare 1 ml di estratto”
Farmacopea Europea	2.5.42. N-Nitrosammine nelle sostanze attive
	Procedura A	“Filtrare il surnatante con un filtro a membrana (dimensione nominale dei pori 0,20 µm)”
	Procedura B Preparazione dei campioni 2	“Se necessario, filtrare il surnatante con un filtro a membrana (dimensione nominale dei pori 0,45 µm)”
Agence Nationale de Sécurité du Médicament et des Produits de Santé (ANSM)	Determinazione di NDMA e NDEA nella sostanza attiva SARTAN mediante HPLC/UV12	“Filtrare un’aliquota… con un filtro a membrana GHP da 0,45”
	Determinazione di NDMA e NDEA nella sostanza attiva valsartan e nei prodotti finiti che la contengono mediante HPLC/UV13	“Filtrare un’aliquota… con un filtro a membrana in PVDF da 0,45”
Health Sciences Agency (HSA) di Singapore	Metodo analitico (LC-MS/MS) per la determinazione di ·   sei nitrosammine in medicinali occidentali)25 ·   N-Nitrosodimetilammina (NDMA) in prodotti a base di metformina e ranitidina26 ·   1-Metil-4-nitrosopiperazina (MNP) nella rifampicina27 ·   N-Nitrososalbutamolo in prodotti a base di salbutamolo28	“... filtro da siringa a membrana (PTFE da 0,2 µm)”
	Metodo analitico per la determinazione di N-Nitrosodimetilammina (NDMA) in prodotti a base di metformina mediante HRAM/GCMS15	“... filtro a membrana (PTFE da 0,2 µm)”
Taiwan Food and Drug Administration	Metodo per la determinazione delle nitrosammine nei medicinali - Analisi multiple (metodo LC-MS/MS)29	“... filtro a membrana: 0,22 μm, PVDF”
	Metodo per la determinazione delle nitrosammine nei medicinali - Analisi multiple (metodo GC-MS/MS)30	“... filtro a membrana: 0,22 μm, PVDF”

Metodi sperimentali

In questo studio si è utilizzato il metodo USP <1469>, Procedura 3 precedentemente convalidato.³¹ La Sezione 1 consiste nello studio degli estraibili dei filtri da siringa appartenenti alla classe delle nitrosammine e la Sezione 2 è uno studio sui recuperi condotto su campioni addizionati di valsartan puro (spiked). Le condizioni di esecuzione delle analisi LC-MS/MS sono riportate in Tabella 3, le transizioni MRM in Tabella 4.

Tabella 3. Condizioni di esecuzione delle analisi LC-MS/MS

Strumento	Agilent 1290 Infinity II accoppiato a uno spettrometro di massa a triplo quadrupolo Agilent 6495C
Colonna	Ascentis® Express C18, 15 cm × 2,3 mm; 2,7 µm
Fase mobile	[A] acqua + acido formico 0,1%; [B] metanolo + acido formico 0,1%
Gradiente	Tempo (min)			A%	B%
			Iniziale	97,0	3,0
			1,5	97,0	3,0
			4,0	50,0	50,0
			7,0	25,0	75,0
			8,1	15,0	85,0
			9,2	5,0	95,0
			12,0	5,0	95,0
			12,1	97,0	3,0
Flusso	0,50 ml/min
Pressione	Pressione iniziale: 320 bar Pressione massima: 460 bar
Temp. colonna	60 °C
Rivelatore	MS, APCI (+), MRM (per i dettagli si rimanda alla Tabella 4)
Iniezioni	20 µL
Campioni	Si rimanda al testo

Tabella 4. Transizioni MRM per le sei nitrosammine di interesse

Picco	Abbreviazione	Nome	MRM	Energia di collisione (V)
1	NDMA	N-nitrosodimetilammina	75,1->43,3	16
2	NMBA	N-nitrosometilfenilammina	147,1->117,1	4
3	NDEA	N-nitrosodietilammina	103,1->75,1	8
4	NEIPA	N-nitrosoetilisopropilammina	117,1->75,1	8
5	NDIPA	N-nitrosodiisopropilammina	131,1->43,3	12
6	NDBA	N-nitrosodibutilammina	159,2->57,1	12

Filtri da siringa esaminati Sono state esaminate tre unità per ciascuno di due lotti di (1) filtri Millex^® in PVDF da 0,22 µm e (2) filtri Millex^® in PTFE da 0,2 µm e tre unità di un lotto per ciascuno dei seguenti filtri: (3) Fornitore P in PVDF da 0,2 µm, (4) Fornitore C in H-PTFE 0,2 µm, (5) Fornitore M in PVDF da 0,2 µm e (6) Fornitore M in PTFE da 0,2 µm.

Sezione 1 - Estraibili. Per determinare se vi fossero livelli di base di nitrosammine di cui tener conto dovuti agli estraibili dei filtri da siringa, un campione costituito da solo diluente (acido formico in acqua, 0,1% v/v) è stato addizionato (spiking) di quattro standard interni (SI) marcati isotopicamente, come previsto dal metodo USP <1469> [10 µg/mL per NDMA-d₆ e NMBA-d₃ e 1 µg/mL per NDEA-d₁₀/NDBA-d₁₈]. Dopo aver vortexato e centrifugato (10.000 rpm per 10 min) i campioni, si è filtrato il surnatante con filtri da siringa di 13 mm. Il filtrato è stato analizzato per la determinazione di sei nitrosammine mediante LC-MS/MS. Per determinare le concentrazioni corrispondenti ci si è avvalsi di una curva di calibrazione esterna che copriva gli intervalli 1,33 - 90 ng/mL (NDMA, NMBA, NEIPA, NDIPA e NDBA) e 0,66-69,4 ng/mL (NDEA).

Sezione 2 - Recuperi. 40 mg di valsartan dura (dose da 80) sono stati polverizzati, diluiti con acido formico all’1% in acqua e addizionati (spiked) di basse concentrazioni (L2) degli analiti, come descritto in USP <1469>. I campioni sono stati centrifugati, filtrati e analizzati mediante LC-MS/MS. 

Esame dei filtri per l'analisi delle nitrosammine

La filtrazione dei campioni prima dell'iniezione è parte integrante di molti metodi per l'analisi delle impurezze da nitrosammine basati su LC-MS e GC-MS. Garantire l'assenza di estraibili nelle unità filtranti è fondamentale ai fini dell'accuratezza e della coerenza dei risultati ottenuti con questi metodi. Inoltre, è essenziale condurre studi sui recuperi, poiché alcune molecole hanno la capacità di legarsi ai componenti dei filtri da siringa e quindi possono influenzare la qualità dei dati generati.

Per valutare i filtri da siringhe ci si è avvalsi di un metodo convalidato basato sulla procedura 3 del metodo USP <1469>²⁷ che descrive l'uso della LC-MS/MS per la quantificazione di NDMA, NDEA, NDIPA, NEIPA, NMBA e NDBA in alcuni sartani (valsartan, losartan potassio, olmesartan medoxomil, candesartan cilexetil e telmisartan). L'ultima parte della sottosezione “Soluzione del campione” del metodo richiede la filtrazione “utilizzando un filtro in politetrafluoroetilene (PTFE) idrofilo con pori di 0,45 μm” dopo la centrifugazione.¹¹

Sezione 1– Estraibili

Il filtrato ottenuto con i filtri da siringa è stato analizzato per determinare le concentrazioni di eventuali estraibili appartenenti alla classe delle nitrosammine utilizzando una curva di calibrazione esterna che copriva gli intervalli 1,33 - 90 ng/ml (NDMA, NMBA, NEIPA, NDIPA e NDBA) e 0,66-69,4 ng/ml (NDEA). In Figura 1 è riportato un cromatogramma d'esempio MRM di questi composti.

Figura 1. Cromatogramma MRM delle soluzioni standard di nitrosammine (10 ng/ml per NDMA, NMBA, NEIPA, NDIPA e NDBA; 6,6 ng/mL per NDEA).

Si definisce limite di quantificazione (LOQ) la concentrazione che dà luogo a un rapporto S/N di 10. Il valore minimo di concentrazione delle curva di calibrazione di ciascuna nitrosammina presa in esame generava un S/N >10. Nessuna delle nitrosammine allo studio è risultata presente in concentrazione pari o superiore a questo valore in nessuno dei filtri analizzati (Tabella 5).

Tabella 5. Risultati della determinazione delle nitrosammine negli estraibili di diversi filtri da siringa, seguendo la<1469>Procedura 3 della USP.

Sostanza	Concentrazione minima della curva di calibrazione (ng/ ml)	S/N	Limite di quantificazione (LOQ)
			Filtri da siringa con membrana in PVDF			Filtri da siringa con membrana in PTFE
			Filtri da siringa Millex®	Fornitore P	Fornitore M	Filtri da siringa Millex®	Fornitore C	Fornitore M
NDMA	1,33	>10	<1,33	<1,33	<1,33	<1,33	<1,33	<1,33
NMBA	1,33	>10	<1,33	<1,33	<1,33	<1,33	<1,33	<1,33
NDEA	0,66	>10	<0,66	<0,66	<0,66	<0,66	<0,66	<0,66
NEIPA	1,33	>10	<1,33	<1,33	<1,33	<1,33	<1,33	<1,33
NDIPA	1,33	>10	<1,33	<1,33	<1,33	<1,33	<1,33	<1,33
NDBA	1,33	>10	<1,33	<1,33	<1,33	<1,33	<1,33	<1,33

ABBREVIAZIONI: S/N = rapporto segnale/ rumore di fondo; PVDF = poli(vinilidene) fluoruro idrofilo; PTFE = politetrafluoretilene idrofilo; LOQ = limite di quantificazione; ND = non rilevato

Accertare che le unità filtranti non presentino estraibili chimici che potrebbero interferire con la qualità dei risultati è fondamentale, soprattutto con i metodi che si avvalgono di strumentazione altamente sensibile. Gli estraibili devono essere evitati perché possono co-eluire con i picchi degli analiti o presentarsi come picchi inattesi nelle successive analisi, rendendo più difficile l'interpretazione dei dati. Gli estraibili potrebbero essere originati da materiali distaccatisi dal filtro, da residui chimici del processo produttivo o da sostanze chimiche secondarie che vengono dilavate dal filtro. Nel caso specifico delle nitrosammine, gli estraibili potrebbero essere generati inavvertitamente durante la colata della membrana (casting).

Sezione 2 - Recuperi nel valsartan

Lo studio dei recuperi è stato eseguito mediante spiking dei campione di valsartan con standard di riferimento a bassi livelli di concentrazione (L2). Le soluzioni campione preparate sono state analizzate mediante LC-MS/MS, utilizzando una curva di calibrazione esterna per calcolare la concentrazione dei singoli analiti. Si è proceduto determinando il rapporto tra il segnale dello standard interno e il segnale dell'analita (ad esempio, segnale della NDMA-D₆/ segnale della NDMA) nella soluzione campione e nelle soluzioni di calibrazione esterna.

La tabella 6 mostra i recuperi medi per i filtri da siringa in PVDF e in PTFE presi in esame. I tassi di recupero erano compresi nell’intervallo di accettabilità che va dal 70 al 130%³¹ per tutte le unità e i materiali saggiati, con alcune piccole differenze evidenti al variare delle sostanze e dei materiali delle membrane. Ad esempio, i recuperi risultano relativamente ridotti per la NDBA (ma ancora nell’intervallo di accettabilità), forse a causa delle interazioni idrofobiche con la matrice filtrante o con altri ingredienti del prodotto farmaceutico. I recuperi dei filtri da siringa Millex^® sia in PTFE, sia in PVDF idrofilo si mantenevano costanti al variare del lotto.

Tabella 6. Recupero percentuale medio di sei nitrosammine. I valori riportati rappresentano la media ± la deviazione standard di n=3 unità esaminate per lotto.

Sostanza	Concentrazione dello spike (ng/ ml)	Filtri da siringa con membrana in PVDF			Filtri da siringa con membrana in PTFE
		Millex®	Fornitore P	Fornitore M	Millex®	Fornitore C	Fornitore M
NDMA	2,0	95,6 ± 2,5	95,6 ± 4,0	91,2 ± 1,2	92,7 ± 0,3	94,6 ± 1,0	94,2 ± 1,2
NMBA	2,0	101,1 ± 1,5	99,9 ± 1,6	97,8 ± 0,2	98,6 ± 2,0	97,5 ± 2,3	101,4 ± 0,2
NDEA	0,88	101,4 ± 2,6	101,9 ± 1,2	99,0 ± 3,4	102,4 ± 1,9	100,2 ± 1,9	98,6 ± 1,6
NEIPA	2,0	95,6 ± 1,1	94,6 ± 3,7	92,1 ± 1,1	99,5 ± 3,1	94,6 ± 2,7	93,1 ± 1,3
NDIPA	2,0	92,4 ± 3,8	94,8 ± 3,7	91,6 ± 2,5	99,5 ± 0,6	98,1 ± 0,2	99,2 ± 1,5
NDBA	2,0	83,6 ± 1,8	85,4 ± 5,9	83,6 ± 3,9	82,1 ± 0,9	85,5 ± 1,5	84,2 ± 3,2

Un altro fattore da considerare quando si scelgono i materiali di fabbricazione dei filtri da siringa è l’adsorbimento aspecifico (binding) delle molecole di analita sull’unità filtrante, fenomeno che potrebbe provocare recuperi scarsi. L'entità dell’adsorbimento è determinata dalle proprietà fisico-chimiche dell’unità filtrante (membrana e alloggiamento) e dalle caratteristiche chimiche dell'analita. Diverse interazioni secondarie, come le interazioni elettrostatiche, i legami a idrogeno e le interazioni idrofobiche, contribuiscono all’adsorbimento dell'analita sul filtro a membrana e sul suo alloggiamento.³² In questo studio, i recuperi relativamente più bassi per l'NDMA osservati sia con le unità filtranti con membrana in PVDF, sia in PTFE (comunque entro l’intervallo di accettabilità) potrebbero essere il risultato di interazioni idrofobiche tra l'NDMA e la membrana. Nel caso della NDIPA, si è ottenuto un tasso di recupero inferiore con le membrane in PVDF, il che significa che la molecola potrebbe interagire in maniera differente con i due polimeri PTFE e PVDF. Altri polimeri con gruppi funzionali polari e maggiore tendenza all’adsorbimento aspecifico, come il nylon, mostrerebbero probabilmente livelli di adsorbimento più elevati e quindi maggiori perdite di analiti. A vantaggio della massima accuratezza nella determinazione dei recuperi, si suggerisce quindi di scartare il primo ml di filtrato durante la preparazione del campione, come raccomandato dai metodi della U.S. FDA per la determinazione delle nitrosammine.^23,24 In questo modo si garantisce che i siti responsabili del binding siano stati saturati dall’analita e non possano causarne ulteriori perdite. Abbiamo osservato questo fenomeno anche con i materiali ad alto tasso di adsorbimento, come il nylon.

Determinazione delle impurezze appartenenti alla classe delle nitrosammine e scelta dei filtri

Tutti i filtri da siringa esaminati, in PVDF e in PTFE, hanno mostrato livelli di estraibili della classe delle nitrosammine inferiori al limite di quantificazione, determinati seguendo la Procedura 3 del metodo USP <1469>. Inoltre, tutti hanno fornito recuperi accettabili degli spike di nitrosammine, mostrando solo minime differenze tra i diversi composti. Ciò dimostra l'idoneità di queste unità filtranti per la preparazione dei campioni nei metodi analitici delle nitrosammine.

Applicazioni correlate

• Analisi e controllo qualità (CQ) di piccole molecole

  Disporre di un sistema di analisi e controllo qualità (CQ) che operi in conformità alle specifiche delle farmacopee internazionali è un fattore critico nella ricerca di nuovi farmaci. Le analisi chimiche e microbiologiche garantiscono che le molecole, grandi o piccole, siano sviluppate e prodotte secondo le Norme di buona fabbricazione (GMP).

• Metodi compendiali e orientamenti normativi

  L’analisi in base a metodi compendiali è parte integrante della messa in commercio di un prodotto farmaceutico. Le farmacopee internazionali, come la USP e la EP, hanno definito i propri standard qualitativi. L’impiego di test conformi agli standard descritti in dettaglio dai metodi compendiali costituisce un requisito fondamentale per gli ingredienti e i prodotti ad uso farmaceutico.

Bibliografia

1. Akkaraju H, Tatia R, Mane SS, Khade AB, Dengale SJ. 2023. A comprehensive review of sources of nitrosamine contamination of pharmaceutical substances and products. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 139105355. https://doi.org/10.1016/j.yrtph.2023.105355

2. Cioc RC, Joyce C, Mayr M, Bream RN. 2023. Formation of N-Nitrosamine Drug Substance Related Impurities in Medicines: A Regulatory Perspective on Risk Factors and Mitigation Strategies. Org. Process Res. Dev.. 27(10):1736-1750. https://doi.org/10.1021/acs.oprd.3c00153

3. Li K, Ricker K, Tsai FC, Hsieh CJ, Osborne G, Sun M, Marder ME, Elmore S, Schmitz R, Sandy MS. Estimated Cancer Risks Associated with Nitrosamine Contamination in Commonly Used Medications. IJERPH. 18(18):9465. https://doi.org/10.3390/ijerph18189465

4. International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use (ICH). 2023. ICH M7(R2) Guideline on assessment and control of DNA reactive (mutagenic) impurities in pharmaceuticals to limit potential carcinogenic risk.

5. Bharate SS. 2021. Critical Analysis of Drug Product Recalls due to Nitrosamine Impurities. J. Med. Chem.. 64(6):2923-2936. https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.0c02120

6. Maundrell N. 2022. Nitrosamine impurities: from raw materials to final drug product. Bioanalysis. 14(2):63-66. https://doi.org/10.4155/bio-2021-0238

7. FDA. Rigorous Detection of Nitrosamine Contaminants in Metformin Products: Balancing Product Safety and Product Accessibility. . [Internet]. Available from: https://www.fda.gov/drugs/news-events-human-drugs/rigorous-detection-nitrosamine-contaminants-metformin-products-balancing-product-safety-and-product

8. European Medicines Agency (EMA). Nitrosamine impurities. . [Internet]. Available from: https://www.ema.europa.eu/en/human-regulatory-overview/post-authorisation/pharmacovigilance-post-authorisation/referral-procedures-human-medicines/nitrosamine-impurities

9. Health Canada. Nitrosamine impurities in medications: Guidance.

10. Pharmaceuticals and Medical Devices Agency (PMDA). Measures against the risk of nitrosamine contamination in pharmaceuticals. . [Internet]. Available from: https://www.pmda.go.jp/safety/info-services/drugs/0371.html

11. Health Sciences Authority. Nitrosamine impurities in medicines. . [Internet]. Available from: https://www.hsa.gov.sg/therapeutic-products/medicines-quality-and-compliance-monitoring/nitrosamine-impurities-in-medicines

12. Taiwan Food and Drug Administration. 2021 Taiwan Food and Drug Administration Annual Report.

13. USP <1469> Nitrosamine Impurities.

14. European Pharmacopeia. 2.5.42. N-Nitrosamines in active substances.

15. Health Sciences Agency (HSA) of Singapore. Nitrosamine impurities in medicines.. [Internet]. Available from: https://www.canada.ca/en/health-canada/services/drugs-health-products/compliance-enforcement/information-health-product/drugs/nitrosamine-impurities/medications-guidance.html

16. Taiwan Food and Drug Administration. Analytical Methods. . [Internet]. Available from: https://www.fda.gov.tw/eng/siteList.aspx?sid=10360

17. Yang J. 2021. LC-HRMS Based Analytical Platform to Determine Nitrosamines in Pharmaceuticals: Modern Analytical Techniques To Meet Regulatory Needs. 2021 FDA Science Forum.

18. Agence nationale de sécurité du médicament et des produits de santé (ANSM). Method reference: 19A0416-01. Determination of NDMA and NDEA in SARTAN drug substances by HPLC/UV.

19. Agence nationale de sécurité du médicament et des produits de santé (ANSM). Method reference: 18A0399-02. Determination of NDMA in valsartan active substances and finished products by HPLC/UV.

20. Swissmedic. Test method 31_PV_171: Nitrosamines by GC-MS/MS.

21. Health Sciences Agency (HSA) of Singapore. 2021. Test method for determination of N-Nitrosodimethylamine (NDMA) in metformin products by HRAM-GCMS.

22. The Importance of Filtration in Optimizing (U)HPLC and LC-MS Performance.. [Internet]. Available from: /CH/it/technical-documents/technical-article/analytical-chemistry/small-molecule-hplc/hplc-filtration-performance-optimizing#filtration-column

23. FDA. 2020. Liquid Chromatography-Electrospray Ionization-High Resolution Mass Spectrometry (LC-ESI-HRMS) Method for the Determination of Nitrosamine Impurities in Metformin Drug Substance and Drug Product.. [Internet]. Available from: https://www.fda.gov/media/138617/download

24. FDA. 2019. Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (LC-HRMS) Method for the Determination of Six Nitrosamine Impurities in ARB Drugs.. [Internet]. Available from: https://www.fda.gov/media/125478/download

25. Health Sciences Agency (HSA) of Singapore. 2021. Test method for determination of six nitrosamine impurities in western medicines by LC-MS/MS.

26. Health Sciences Agency (HSA) of Singapore. 2021. Test method for determination of N-Nitrosodimethylamine (NDMA) in metformin and ranitidine products by LC-MS/MS.

27. Health Sciences Agency (HSA) of Singapore. 2021. Test method for determination of 1-Methyl-4-Nitrosopiperazine (MNP) in rifampicin.

28. Health Sciences Agency (HSA) of Singapore. 2021. Test method for determination of N-Nitroso Salbutamol in salbutamol products by LC-MS/MS.

29. Taiwan Food and Drug Administration. 2020. Method of Test for Nitrosamines in Medicines - Multiple Analysis (LC-MS/MS Method).

30. Taiwan Food and Drug Administration. 2020. Method of Test for Nitrosamines in Medicines - Multiple Analysis (GC-MS/MS Method).

31. Muller T, Appelblad P. 2023. Nitrosamine testing using LC-MS methods using USP General Chapter <1469>. Analytix Reporter. 14:15-19.

32. Filter Validation Studies for Pharmaceutical QC – Factors Affecting Analyte Binding. . [Internet]. Available from: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/technical-article/analytical-chemistry/filtration/millex-filter-analyte-binding