Concentrazione di urine con i filtri centrifughi Amicon^® Ultra

Una determinazione quantitativa accurata di proteine specifiche nelle urine è importante per la diagnosi e la cura di alcune malattie. Tuttavia, la concentrazione delle proteine nelle urine spesso è inferiore al limite di rivelabilità dei test clinici. Per concentrare campioni di urina prima delle analisi di laboratorio clinico, è possibile utilizzare i dispositivi Amicon^® Ultra-4 mL con MWCO di 10 kDa.

Metodo

Arricchimento di catene leggere libere di immunoglobulina (proteine di Bence-Jones) in campioni di urina utilizzando i filtri Amicon^® Ultra-4 mL con MWCO di 10 kDa.

1. Determinare le proteine totali in un campione di urine delle 24 ore.
2. Riempire un’unità Amicon^® Ultra-4mL con 4 mL di urina.
3. Centrifugare a 3.400 x g per 30–45 minuti, fino a ottenere circa 25–50 μL di campione concentrato; la concentrazione raggiunta sarà circa 160 volte maggiore di quella del campione originario.
4. Introdurre un puntale di pipetta in fondo all’unità filtrante e prelevare il campione concentrato.
5. Sottoporre il concentrato a risoluzione elettroforetica su gel di agarosio per quantificare le catene leggere e per individuare le altre proteine. Determinare la percentuale di catene leggere in riferimento ai componenti totali delle urine. Moltiplicare quindi la percentuale di catene leggere per la concentrazione delle proteine totali delle 24 ore (grammi di catene leggere per volume delle 24 ore).
6. Sottoporre il concentrato a immunoelettroforesi per identificare le catene leggere.

Risultati della risoluzione elettroforetica di catene leggere libere di immunoglobulina (proteine di Bence-Jones) in campioni di urina concentrati utilizzando i dispositivi centrifughi Centricon® (C) e Amicon® Ultra (A). Le bande scure a ~25 kDa in tutte le corsie corrispondono a queste proteine.

Annotazioni integrative

1. Nel campione concentrato di urina, l’immunoelettroforesi può rivelare anche le diverse immunoglobuline normali con un “effetto scala” dovuto alla microeterogeneità delle catene leggere. Le proteine di Bence-Jones possono trovarsi all’interno di questa sequenza di bande. Per verificare la presenza delle proteine di Bence-Jones sono necessarie ulteriori analisi mediante elettroforesi bidimensionale.
2. Nel caso si riscontri un eccesso di antigene, bisognerà procedere alla diluizione del concentrato fino a trovare il giusto equilibrio tra antigene (proteine di Bence-Jones) e anticorpo.

Prodotti correlati

1. I dispositivi Amicon^® Ultra sono idonei anche per la concentrazione di siero, plasma e liquido cefalorachidiano prima di analisi di questo tipo. Per poter individuare le catene leggere libere mediante elettroforesi in campioni di fluidi biologici di malati, è necessario raggiungere una concentrazione nell’ordine di circa 20 mg/mL. L’immunoelettroforesi è 10 volte più sensibile dell’elettroforesi su gel di agarosio.
2. Per concentrare le proteine di Bence-Jones nelle urine, si può ricorrere anche aconcentratori statici (unità Minicon^®).

Ringraziamenti

Lo studio sull’impiego dei dispositivi Amicon^® Ultra per la concentrazione delle urine come descritto in questo protocollo è stato condotto da Mark Merchant, Ph.D. presso Helena Laboratories, Beaumont, TX.

Bibliografia

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