Concentrazione rapida di anticorpi con i filtri centrifughi Amicon^® Ultra

Introduzione

I protocolli di purificazione delle immunoglobuline generalmente includono il binding a una resina per cromatografia di affinità funzionalizzata con proteina A o G, il lavaggio delle proteine non legate e l’eluizione con un tampone a basso pH. Poiché gli anticorpi purificati risultanti sono spesso troppo diluiti per gli studi successivi o per lo stoccaggio a lungo termine, spesso è necessario ricorrere alla dialisi per concentrarli e/o scambiare il tampone con uno che ne preservarvi l’attività biologica. L'ultrafiltrazione consente di ottenere lo stesso risultato più rapidamente, con tassi di recupero delle immunoglobuline fino del 99% e la rimozione dei sali in un unico passaggio (si veda il protocollo Concentrazione, dissalazione e scambio di tampone).

Metodo e risultati

Purificazione e concentrazione di IgG di coniglio con i kit Montage^® per la purificazione di anticorpi, che si avvalgono delle resine Prosep^® A e Prosep^® G, e i filtri centrifughi Amicon^® Ultra-15 mL.

A. Purificazione delle IgG con i kit Montage^®

1. Equilibrare la resina Prosep^® A o Prosep^® G con 10 mL di tampone di binding e centrifugare per 5 min a 500 xg
2. Pre-chiarificare il campione di siero con un filtro Steriflip^® GP da 0,22 µm.
3. Diluire 1:1 il campione con il tampone di binding A, pipettare il campione nella colonnina da centrifuga e centrifugare il dispositivo a 100-150 x g per 20 min.
4. Lavare la colonnina con 20 mL di tampone di binding A e centrifugarla per 5 min a 500 x g per rimuovere i contaminanti non legati.
5. Aggiungendo 10 mL di tampone di eluizione B2, eluire il campione in una nuova provetta da centrifuga contenente 1,3 mL di tampone di neutralizzazione.
6. Determinare la concentrazione delle proteine totali del campione con un metodo appropriato, ad esempio l’assorbanza nell’UV a 280 nm.

B. Concentrazione delle IgG usando le unità Amicon^® Ultra-15 con MWCO di 30kDa

1. Aggiungere la frazione eluita e neutralizzata nell’unità Amicon^® Ultra 15 mL con MWCO di 30kDa.
2. Centrifugare per 10-20 min a 4.000 x g in un rotore basculante o a 5.000 x g in un rotore ad angolo fisso fino a che il campione non abbia raggiunto la concentrazione desiderata.