Introduzione alla SDS-PAGE - Separazione delle proteine in base alle dimensioni

I gel di poliacrilammide si ottengono per reazione dell’acrilammide con la bis-acrilammide (N,N’-metilenebisacrilammide) che genera una matrice di gel altamente reticolata. Il gel funziona come un setaccio in cui le proteine si spostano in risposta a un campo elettrico. Le proteine sono cariche positivamente o negativamente e questa proprietà fa sì che esse si spostino verso il punto isoelettrico in cui la molecola è priva di carica netta. Denaturando le proteine e dotandole di una carica negativa uniforme, è possibile separarle in base alle dimensioni man mano che migrano verso l’elettrodo positivo.

Figura 1. SDS-PAGE di campioni di proteine e marcatore di pesi molecolari ColorBurst (C1992)

Protocollo

Materiali e reagenti necessari

• Camera elettroforetica verticale con alimentatore elettrico, lastre di vetro, spaziatori e pettini

Reagenti necessari	Componenti del reagente	N° Catalogo
Soluzione di acrilammide/bis-acrilammide	Acrilammide 29,2 g Bis-acrilammide 0,8 g	01696 M7279
Tamponi di colatura del gel	Tris-HCl 1,5 M, pH 8,8 (per preparare il gel di separazione o resolving gel): Sciogliere 18,15 g di Tris base in 80 mL di acqua distillata. Correggere il pH portandolo a 8,8 con HCl 6N. Portare il volume finale a 100 mL con acqua distillata. Tris-HCl 0,5 M, pH 6,8 (per preparare il gel di impaccamento o stacking gel): Sciogliere 6 g di Tris base in 80 mL di acqua distillata. Correggere il pH portandolo a 6,8 con HCl 6N. Portare il volume finale a 100 mL con acqua distillata.	93362
Tampone di Laemmli 2X per il caricamento	Blu di bromofenolo 0,004% 2-Mercaptoetanolo 10% Glicerolo 20% SDS 4% Tris-HCl 0,125 M	B5525 M3148 G5516 L3771 93362
Tampone di corsa 10X	Tris-HCl 25 mM Glicina 200 mM SDS 0,1% (p/v)	93362 G8898 L3771
SDS 10%	SDS	L3771
Ammonio persolfato 10%	Ammonio persolfato	A3678
TEMED	TEMED	T9281

NOTA: l’acrilammide e la bis-acrilammide sono sostanze neurotossiche, quindi tutti questi passaggi vanno eseguiti indossando guanti non talcati.

Preparazione del gel

• Pulire con acqua deionizzata ed etanolo le lastre di vetro e gli spaziatori dell’unità di colatura del gel.
• Assemblare le lastre con gli spaziatori su una superficie stabile e piana.
• Preparare la soluzione del gel di separazione utilizzando i volumi sotto indicati (per 10 mL) a seconda della percentuale di gel richiesta.

% del gel	Acqua (mL)	Acrilammide 30% (mL)	Tris-HCl 1,5 M, pH 8,8 (mL)	SDS 10% (µL)	APS 10% (µL)	TEMED*(µL)
8%	4,6	2,6	2,6	100	100	10
10%	3,8	3,4	2,6	100	100	10
12%	3,2	4,0	2,6	100	100	10
15%	2,2	5,0	2,6	100	100	10
*Il TEMED deve essere aggiunto per ultimo.

• Versare la soluzione del gel nelle piastre preassemblate con gli spaziatori. Perché la superficie del gel di separazione rimanga uniforme e orizzontale, sovrapporvi acqua o isopropanolo (I9516).
  
• Lasciar polimerizzare il gel per circa 20–30 minuti a temperatura ambiente.
  
• Preparare la soluzione del gel di impaccamento utilizzando i volumi sotto indicati (per 10 mL).
  

% del gel	Acqua (mL)	Acrilammide 30% (mL)	Tris-HCl 0,5 M, pH 6,8 (mL)	SDS 10% (µL)	APS 10% (µL)	TEMED*(µL)
5%	5,86	1,34	2,6	100	100	10

*Il TEMED deve essere aggiunto per ultimo.

• Scartare l’acqua o l’isopropanolo al di sopra del gel di separazione.
• Aggiungere la soluzione di impaccamento al 5% finché non trabocca. Inserire immediatamente il pettine accertandosi che non vi siano bolle d’aria intrappolate nel gel o intorno ai pozzetti.
• Lasciar polimerizzare il gel per circa 20–30 minuti a temperatura ambiente.
  

Preparazione dei campioni

• A un dato volume di campione proteico (lisato o tessuto cellulare), aggiungere un egual volume di tampone per il caricamento.
  
• Far bollire questa miscela a 95 °C per 5 minuti, quindi centrifugare a 16.000xg per 5 minuti.
  
• Questi campioni possono essere conservati a -20 °C oppure usati direttamente nell’elettroforesi su gel.

Colorazione del gel

Colorazione con blu di Coomassie: la colorazione dei gel di proteine con il colorante Coomassie Brilliant Blue R-250 è una procedura standard per visualizzare le proteine separate mediante SDS-PAGE. È molto sensibile ed è adatta per la conservazione prolungata dei gel.

Reagenti necessari

• Soluzione fissante per gel (500 mL)
  
       Metanolo (M3641) 250 mL
       Acido acetico glaciale (695092) 50 mL
       Acqua 200 mL
  
  
• Soluzione di Coomassie
  
       CBB R-250 (B6529) 0,1%
       Metanolo (M3641) 40%
       Acido acetico glaciale (695092) 10%
       Filtrare la soluzione colorante con carta da filtro Whatmann N. 1.
  
  
• Soluzione decolorante
  
       Metanolo (M3641) 50 mL
       Acido acetico glaciale (#695092) 35 mL
  
  
• Soluzione conservante per gel
  
       Acido acetico glaciale (695092) 25 mL
       Acqua 475 mL

Procedura

• Terminata l’elettroforesi, immergere il gel in una vaschetta di plastica contenente la soluzione fissante. Appoggiare la vaschetta sopra un agitatore e fissare le proteine per 2 ore.
  
• Rimuovere la soluzione fissante e aggiungere quella con Coomassie.  Appoggiare la vaschetta sull’agitatore e colorare il gel per 2-4 ore.
  
• Al termine, lavare molte volte il gel con acqua distillata per rimuovere il colorante in eccesso.
  
• Aggiungere la soluzione decolorante alla vaschetta contenente il gel. Appoggiare la vaschetta sull’agitatore e decolorare per circa 4 ore, finché non sono visibili chiaramente delle bande blu su fondo trasparente.
  
• Dopo la decolorazione, i gel possono essere conservati nella soluzione conservante e fotografati secondo necessità.

Colorazione argentica

Offriamo un kit di rivelazione delle proteine basata sulla colorazione argentica altamente sensibile e adatto ai gel di SDS-PAGE. Per questo tipo di colorazione sono necessari anche:

• Soluzione fissante
  
       Etanolo (E7023) 50 mL
       Acido acetico 10 mL
       Acqua 40 mL
  
  
• Soluzione di etanolo (E7023) 30%

Procedura

• Dopo la corsa elettroforetica, immergere il gel nella soluzione fissante per 40 minuti. Se l’immersione nel fissativo dura tutta la notte, il background sarà più trasparente.
  
• Rimuovere la soluzione fissante e lavare il gel per 10 min con la soluzione di etanolo 30%, quindi lavare con acqua ultrapura per 10 min.
  
• Far decantare l’acqua, quindi incubare il gel nella soluzione sensibilizzante per 10 minuti.
  
• Rimuovere la soluzione sensibilizzante e lavare il gel per due volte con acqua, ogni volta per 10 minuti.
  
• Far decantare l’acqua, quindi immergere il gel nella soluzione argentica per 10 minuti.
  
• Far decantare la soluzione argentica, quindi lavare il gel in acqua per 1,5 minuti.
  
• Scartare l’acqua, quindi immergere il gel nella soluzione di sviluppo per 3-7 minuti.
  
• Aggiungere 5 mL di soluzione per interrompere la reazione e incubare per 5 minuti. Rimuovere la soluzione di sviluppo/interruzione e lavare il gel in acqua ultrapura per 15 minuti.
  
• Il gel può quindi essere fotografato e anche conservato in acqua ultrapura.

Per la doppia colorazione, colorare prima il gel con CBB R-250 quindi procedere alla colorazione argentica mediante la procedura descritta sopra.

Colorazioni fluorescenti: la nostra offerte comprende i coloranti fluorescenti SYPRO e Lucy per l’elettroforesi delle proteine. I gel possono essere immersi nel colorante fluorescente al buio oppure il gel può essere miscelato con il tampone del catodo durante l’elettroforesi.

I protocolli di colorazione dipendono dal colorante usato e sono reperibili qui:

• Colorante SYPRO^® Ruby per proteine su gel (PDF)
  
• Soluzione LUCY^® 506 (PDF)
  

Colorazione reversibile del gel

I coloranti per gel reversibile consentono all’operatore di procedere al Western blotting delle proteine dopo la corsa su gel di SDS-PAGE.

Colorazione con R-PROB: R-PROB è un colorante peculiare che rileva le proteine su gel PAGE e sui Western blot.

Reagenti necessari

• Kit per la rivelazione reversibile delle proteine per membrane e gel di poliacrilammide (RPROB)
  
• Soluzione fissante (F7264)
  
• Acido acetico 10%
  
• EDTA 50 mM

Procedura

• Dopo l’elettroforesi, immergere il gel in soluzione fissante per 20 minuti. Ripetere questo passaggio due volte.
  
• Risciacquare il gel in acqua con due lavaggi di 30 minuti ciascuno.
  
• Incubare il gel nella soluzione colorante per 20-40 minuti sotto leggera agitazione.
  
• Togliere l’eccesso di colorante con acido acetico 10%.
  
• Per la decolorazione, lavare il gel con EDTA seguito da due lavaggi di 15 minuti ciascuno in acqua o soluzione fissante.

Colorazione con rame: per confermare la migrazione e la separazione delle proteine, il gel può essere colorato con un colorante reversibile come il CuCl₂.

Reagenti necessari

• Soluzione di CuCl₂ 0,3 M
  
• Soluzione di Tris 0,25 M e EDTA 0,25 M

Procedura

• Al termine dell’elettroforesi, risciacquare il gel in acqua distillata per non più di 30 minuti.
  
• Immergere il gel nella soluzione di CuCl₂ 0,3 M per 10 minuti.
  
• Risciacquare con acqua deionizzata.
  
• Le proteine sono visualizzabili come zone trasparenti su sfondo blu.
  
• Per decolorare completamente il gel per il Western blotting, lavarlo più volte con la soluzione di Tris 0,25 M e EDTA 0,25 M, pH 9.
  
• Spostare il gel decolorato in una vaschetta contenente il tampone di trasferimento prima di allestire il sistema di trasferimento.

Figura 2. Sistema elettroforetico verticale e sistema di blotting

Se dopo l’elettroforesi si desidera trasferire le proteine su una membrana, seguire il protocollo indicato qui.

Prodotti

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Riferimenti bibliografici

1. Sambrook J, Fritsch T, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.