Immunpräzipitation von FLAG-Fusionsproteinen mit Affinitätsgelen monoklonaler Antikörper

• Was ist das FLAG-Peptid-Tag und wie wird es für die Isolierung und Aufreinigung von Proteinen verwendet?
• Technischer Überblick über die Immunpräzipitation
• Protokoll für die Immunpräzipitation (IP) von FLAG-Fusionsproteinen unter Einsatz von M2-Affinitätsgelen
• Aufreinigung kleiner Mengen FLAG-Fusionsproteine

Die Immunpräzipitation (IP) kann für eine effiziente, ertragreiche Isolierung und Aufreinigung von Proteinen verwendet werden, die an das FLAG^® Peptid-Tag fusioniert sind. IP wird mit dem Affinitätsgel ANTI-FLAG^® M2 durchgeführt, einem hochspezifischen monoklonalen Antikörper, der kovalent an Agaroseharz gebunden ist. Das Affinitätsharz ermöglicht eine effiziente Bindung von FLAG^® markierten Proteinen ohne erforderliche Vorstufen und Kalibrierungen. Die immunpräzipitierten FLAG^® markierten Fusionsproteine können unter sauren Bedingungen oder durch Konkurrenz mit FLAG^® Peptiden effizient aus dem Harz eluiert werden. Die immunpräzipitierten Proteine können dann auf ihre Größe, posttranslationale Modifikationen und Gel-Interaktionen während der Elektrophorese sowie durch Aktivitätsassays analysiert werden.

Was ist das FLAG-Peptid-Tag und wie wird es für die Isolierung und Aufreinigung von Proteinen verwendet?

FLAG^® Peptide sind Markerpeptide, die für den Nachweis und die Aufreinigung von Proteinen verwendet werden. Das FLAG^® Tag-Peptid besteht aus acht Aminosäuren (DYKDDDDK), durch welche die Immunogenität maximiert wird, sodass hochaffine monoklonale Antikörper, die gegen die FLAG^® Sequenz gerichtet werden, zum Nachweis und zur Isolierung von Proteinen, die das FLAG^® Peptid enthalten, verwendet werden können. Mit Hilfe der rekombinanten Technik können FLAG^® Markerpeptide am N-Terminus des Proteins, am C-Terminus oder am N-Terminus, dem ein Methioninrest vorangestellt ist (Met-FLAG^®), sowie an internen Positionen angebracht werden.

Technischer Überblick über die Immunpräzipitation

Die Immunpräzipitation besteht aus folgenden Schritten und Zwischenschritten: Zelllyse, Bindung eines spezifischen Antigens an einen Antikörper, Antikörper-Antigen-Komplex, Ausfällung, Waschen des Fällungsmittels und Dissoziation des Antigens aus dem Immunkomplex.

Protokoll für die Immunpräzipitation (IP) von FLAG-Fusionsproteinen unter Verwendung von M2-Affinitätsgelen, die monoklonale M2-Antikörper enthalten, die kovalent an vernetzte 4 %-Agarose-Beads gebunden sind

EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinitätsgel F2426 oder ANTI-FLAG M2 Affinitätsgel A2220 verwenden.

Aufreinigung kleiner Mengen FLAG-Fusionsproteine

Hinweis: Für das Verfahren der Immunpräzipitation werden zwei Kontrollreaktionen empfohlen

• Positivkontrolle (FLAG-BAP-Fusionsprotein, wie das Amino-terminale P7582, das Carboxy-terminale P7457 oder das Met-FLAG-BAP-Fusionsprotein P5975)
• Negativkontrolle (Reagenzienblindprobe OHNE Protein)

a) Die Affinitätsgel-Beads vorsichtig mischen, bis sie vollständig suspendiert sind. Sofort 40 µl der 50 % Aufschlämmung (20 µl des gepackten Gelvolumens) in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen unter Verwendung einer Pipettenspitze mit breiter Öffnung oder einer um 1 mm abgeschnittenen normalen Pipettenspitze aliquotieren.

b) Beads waschen/äquilibrieren: 500 µl TBS (50 mM Tris HCL, 150 mM NaCl, pH 7,4) zugeben, vortexen und 30-60 Sekunden bei 5000–8200 x g zentrifugieren. Den Überstand entfernen, dabei darauf achten, dass die Beads nicht gestört werden.

c) Erneut wie weiter oben beschrieben waschen und das Röhrchen auf Eis stellen, bis die Probe zugegeben werden kann. Hinweis: Wenn mehrere Immunpräzipitationsproben gleichzeitig verarbeitet werden, kann die kombinierte benötigte Menge an Harz zusammen gewaschen werden. Jeder Waschvorgang soll mit TBS in einem Volumen durchgeführt werden, das mindestens dem 20-fachen des gesamten gepackten Gelvolumens entspricht. Nach dem Waschen kann das Harz für die gewünschte Anzahl von Proben aliquotiert werden.

d) Probenvorbereitung:

• Das Zelllysat durch Zentrifugation (14.000 x g 10-15 min bei 2–4°C) klären.
• Die benötigte Lysatmenge berechnen. Das Volumen hängt von der Expressionsstärke des FLAG-Fusionsproteins in den transfizierten Zellen ab.

e) Binden: 200-1000 µl Zelllysat zugeben (falls erforderlich, das Endvolumen durch Zugabe von Lysepuffer [50 mM Tris HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 % Triton X-100] auf 1 ml bringen). Hinweis: Das Volumen des Lysats hängt vom Expressionsniveau des FLAG-Fusionsproteins in den transfizierten Zellen ab. Für die Positivkontrolle 1 ml TBS und 4 µl 50 ng/µl FLAG-BAP-Fusionsprotein (ca. 200 ng) hinzufügen. Für die Negativkontrolle nur 1 ml Lysepuffer zugeben. Alle Proben und Kontrollen unter Schütteln mit einem Rollenschüttler oder End-Over-End-Schüttler für etwa 1-2 Stunden bei 2–8 °C inkubieren (der Bindungsschritt kann über Nacht verlängert werden, damit eine maximale Bindung sichergestellt wird).

f) Das Röhrchen 30 sec bis 1 min bei 5000–8200 x g zentrifugieren und den Überstand absaugen (Durchfluss). Die Durchflussmenge kann auf Wunsch beibehalten werden.

g) Die Beads waschen: 500 µl TBS zugeben, vortexen und 30 sec bis 1 min bei 5000–8200 x g zentrifugieren. Den Überstand entfernen.

h) Den Waschvorgang zweimal wiederholen.

i) Elution der Probe: Es können drei Elutionsmethoden durchgeführt werden, wobei die Wahl von den Eigenschaften des markierten Proteins und der nachgeschalteten Anwendung abhängt.

1. Die Elution des FLAG-Fusionsproteins kann unter nativen Bedingungen durch Konkurrenz mit dem 3X FLAG-Peptid (F4799) erreicht werden. Diese Elution ist die effizienteste Methode.
2. Die Elution kann unter sauren Bedingungen mit 0,1 M Glycin-HCl, pH 3,5, durchgeführt werden. Diese Elutionsmethode ist schnell und effizient, erfordert aber eine sofortige Neutralisierung der Probe.
3. Die Elution kann durch Elektrophorese mit SDS-PAGE-Probenpuffer erfolgen. Wird diese Methode angewandt, können die Beads nicht erneut verwendet werden, da durch SDS der M2-Antikörper denaturiert wird.

Elution mit 3X FLAG-Peptid (F4799)

i. Herstellung des 3X FLAG-Peptids:

• Das 3X FLAG-Peptid in 0,5 M Tris HCL, pH 7,5, 1 M NaCl in einer Endkonzentration von 25 µg/µl auflösen
• Die Stammlösung 5-fach mit diH₂0 auf eine Endkonzentration von 5 µg/µl verdünnen
• Die Elutionsgebrauchslösung mit 150 ng/µL vorbereiten, indem 3 µl der 5 µg/µl Stammlösung zu 100 µl TBS hinzugefügt werden.

ii. 100 μl der 3X FLAG-Elutionsgebrauchslösung zu jeder Probe geben und 30 min bei 2–8 °C unter leichtem Schütteln inkubieren.

iii. 30 sec bis 1 min bei 5000–8200 x g zentrifugieren. Den Überstand in ein frisches Röhrchen überführen. Darauf achten, kein Harz zu übertragen.

1. Elution unter sauren Bedingungen (0,1 M Glycin Hcl, pH 3,5). Das Verfahren wird bei Raumtemperatur durchgeführt.

i. 100 µl 0,1 M Glycin HCl, pH 3,5, zu jeder Probe zugeben
ii. 5-10 Minuten unter leichtem Schütteln inkubieren
iii. Das Harz 30 sec bis 1 min bei 5000–8200 x g zentrifugieren
iv. Die Probe durch Überführen des Überstands in neue Röhrchen, die 10 µl 0,5 M Tris HCl, pH 7,4 enthalten, mit 1,5 M NaCl neutralisieren.
v. Sofort verwenden oder über einen längeren Zeitraum bei -20°C lagern.

2. Elution mit SDS-PAGE-Probenpuffer (62,5 mM Tris HCl, pH 6,8 mit 2 % SDS, 10 % (v/v) Glycerin und 0,002 % Bromphenolblau). Das Verfahren wird bei Raumtemperatur durchgeführt.

Hinweis: Um die Denaturierung der Antikörper zu minimieren, soll kein Reduktionsmittel (DTT oder 2-Mercaptoethanol) zugesetzt werden. Die Zugabe von Reduktionsmitteln führt zur Dissoziation der schweren und leichten Ketten des immobilisierten M2-Antikörpers (25–50 kDa-Banden)

i. Jeder Probe 20 µl des 2X Probenpuffers hinzufügen
ii. Die Proben 3 min kochen
iii. 30 sec – 1 min bei 5000–8200 x g zentrifugieren
iv. Überstand in ein neues Röhrchen überführen. Die Proben sind für die Beladung in SDS-PAGE vorbereitet.

 

Abbildung 1. Zusammenfassung der Optionen für die Immunpräzipitation im Batch-Modus für gering abundante Proteine